謝珊珊，楊 琴，鄧肖玉，易繼海，王 震，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心,石河子 832000；3.動(dòng)物疫病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000)

布魯氏菌病是一種由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，對(duì)人類健康和畜牧經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有極大威脅[1]。布魯氏菌致病機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵是其與宿主細(xì)胞的相互作用，它能夠利用自身的多種機(jī)制逃避宿主細(xì)胞的識(shí)別及殺傷，適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境并進(jìn)行復(fù)制及生存[2]。布魯氏菌侵入細(xì)胞后，可通過調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡過程影響布魯氏菌的胞內(nèi)存活[3-4]。線粒體是細(xì)胞供能的主要細(xì)胞器，其形態(tài)的異常和功能的紊亂是造成細(xì)胞凋亡的主要因素[5]。研究表明，布魯氏菌感染后會(huì)破壞線粒體的形態(tài)，引起線粒體發(fā)生腫脹、嵴減少和斷裂[6]，布魯氏菌也常常會(huì)因?yàn)榇蚱凭€粒體正常的功能運(yùn)轉(zhuǎn)環(huán)境，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

線粒體融合蛋白2 (mitochondrial fusion protein 2，MFN2)是位于線粒體外膜的蛋白，通過調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)，間接調(diào)控其功能及細(xì)胞凋亡[7]，同時(shí)也是維系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體物理連接的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間的鈣離子傳遞至關(guān)重要[8]，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過程中扮演著重要角色[9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，MFN2與抗病毒感染密切相關(guān)，MFN2可作為抗病毒信號(hào)的抑制劑[10]。Lee等[11]研究表明，巨噬細(xì)胞中MFN2的過表達(dá)促進(jìn)了結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)，MFN2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)存活。結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌都是兼性胞內(nèi)寄生菌，但MFN2在布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞過程中發(fā)揮的作用還未明確，深入探索MFN2的功能可為進(jìn)一步解析布魯氏菌的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

本研究通過RNA干擾和過表達(dá)技術(shù)對(duì)MFN2基因進(jìn)行改造，建立MFN2基因的干擾和過表達(dá)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，用布魯氏菌侵染干擾和過表達(dá)MFN2基因的細(xì)胞，進(jìn)而探究MFN2基因干擾及過表達(dá)對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，以期為MFN2基因功能的研究及布魯氏菌致病機(jī)制的解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和牛種布魯氏菌A19疫苗株(Brucellaabortus vaccine strain A19)為動(dòng)物疫病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗B淋巴細(xì)胞-2相關(guān)X蛋白(BAX)單克隆抗體(14796S)購自CST公司；兔抗線粒體融合蛋白2(MFN2)單克隆抗體(ab124773)購自Abcam公司；RNA提取試劑盒(CW0581)和cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2569)購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(abs50001)購自上海愛必信生物科技有限公司；Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑(AD6OOO50)購自Zeta Life公司。高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument)購自賽默飛世爾科技公司；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購自BD公司；SDS-PAGE電泳儀(DYY-7C)購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)(SYSTEM Gel Doc XR+)購自Bio-Rad公司。

1.2 siRNA與引物的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank中查找MFN2基因序列(登錄號(hào)：NM_133201)和BAX基因序列(登錄號(hào)：NM_173894)，利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)針對(duì)MFN2基因的3條特異性siRNA序列siMFN2-450、siMFN2-1161和siMFN2-2275和1條陰性干擾對(duì)照siMFN2-Negative序列(表1)；用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MFN2和BAX基因的引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定

利用DNA純化回收試劑盒回收MFN2基因目的片段后，用pcDNA3.1-EGFP載體在T4 DNA連接酶的作用下4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，放入搖床中37 ℃震蕩40～60 min，隨后接種到含有氨芐西林(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，倒置放于37 ℃隔水培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)10 h后，挑取陽性菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系20 μL：Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。鑒定正確的重組質(zhì)粒送成都生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切反應(yīng)體系為20 μL，其中pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒8 μL，兩種內(nèi)切酶各1 μL,10× Buffer 2 μL，ddH2O 8 μL，37 ℃酶切4 h。

1.4 MFN2干擾和過表達(dá)的轉(zhuǎn)染及鑒定

1.4.1 siRNA及pcDNA3.1-EGFP-MFN2的轉(zhuǎn)染 干擾組按終濃度50 nmol/L分別取siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275和siMFN2-Negative(對(duì)照)各5 μL，再分別與5 μL Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑混勻；過表達(dá)組分別取6 μg的pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒和pcDNA3.1-EGFP空質(zhì)粒，再分別與6 μL的Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑混合，將混合物室溫孵育10～15 min。最后，將制備好的混合物分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞中，正常生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組(NC)，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。在轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞檢測(cè)MFN2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MFN2的干擾及過表達(dá)效率 轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol裂解細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書和cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MFN2的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR 5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)對(duì)照，每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞做3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 Western blotting檢測(cè)MFN2的干擾及過表達(dá)效率 轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，加入200 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，13 000 r/min離心10 min，留上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜、洗膜，室溫封閉(0.5 g脫脂奶粉+10 mL TBST) 2 h，與MFN2單克隆抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，與二抗(1∶5 000)常溫共孵育2 h，用顯色液在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，觀察并拍照。

1.5 MFN2對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

1.5.1 布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞 干擾和過表達(dá)MFN2的巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行布魯氏菌侵染。將提前接種且活化的布魯氏菌8 000 r/min離心5 min，收集菌液，按照一定的比例稀釋后用比濁儀測(cè)定菌液的濃度，按照細(xì)菌數(shù)量∶細(xì)胞個(gè)數(shù)=100∶1的侵染比例將菌液加到細(xì)胞中，布魯氏菌侵染分為干擾組(siMFN2-1661組、siMFN2-Negative組和未轉(zhuǎn)染組)和過表達(dá)組(pcDNA3.1-EGFP-MFN2組、pcDNA3.1-EGFP組和未轉(zhuǎn)染組)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入慶大霉素繼續(xù)孵育45 min；孵育完畢后漂洗、換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至6、12和24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)BAX的轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 分別提取1.5.1中收集細(xì)胞的RNA和蛋白，按照1.4.2和1.4.3操作步驟對(duì)BAX進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.5.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將1.5.1中各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的0.25%的胰酶進(jìn)行消化，800 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌3次，然后用Binding Buffer重懸細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞處理后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，Image J軟件計(jì)算蛋白表達(dá)灰度值，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MFN2過表達(dá)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

由圖1可知，在6 000 bp處出現(xiàn)與pcDNA3.1-EGFP載體片段大小相符的條帶，在2 000 bp處出現(xiàn)與插入基因MFN2大小相符的條帶，結(jié)果與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果顯示，鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒序列與GenBank上發(fā)表的MFN2基因序列一致，表明pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，DL1000 DNA Marker；1，pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切；2，pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒M,DL1000 DNA Marker;1,Double digestion of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid by Hind Ⅲ and BamH Ⅰ;2,pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid圖1 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-EGFP-MFN2

2.2 siRNA及pcDNA3.1-EGFP-MFN2的轉(zhuǎn)染

2.2.1 MFN2干擾序列的篩選與驗(yàn)證 干擾序列轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，與siMFN2-Negative組相比，3條干擾序列均能抑制MFN2的轉(zhuǎn)錄，siMFN2-1661處理組MFN2相對(duì)表達(dá)量最低，且極顯著(P<0.01)(圖2A)，siMFN2-450處理組顯著抑制MFN2的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)；Western blotting結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果相符(圖2B、2C)，因此siMFN2-1661為最佳干擾序列，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

①A，MFN2干擾序列實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；B，MFN2干擾序列Western blotting檢測(cè)；C，蛋白的相對(duì)表達(dá)量。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A,Real-time quantitative PCR detection of MFN2 interference sequences;B,Western blotting detection of MFN2 interference sequences;C,Relative expression of protein.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05).The same as below圖2 MFN2干擾序列的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)Fig.2 Real-time quantitative PCR and Western blotting detection of MFN2 interference sequences

2.2.2 MFN2重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定 由圖3可知，細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染成功，可用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。重組過表達(dá)質(zhì)粒結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒過表達(dá)的巨噬細(xì)胞中MFN2的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均極顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP組(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP組與未轉(zhuǎn)染組無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A、B，pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的明、暗場(chǎng)視野；C、D，pcDNA3.1-EGFP-MFN2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的明、暗場(chǎng)視野A and B,Light and dark fields of pcDNA3.1-EGFP transfected cells;C and D,Light and dark fields of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 transfected cells圖3 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果(40×)Fig.3 Transfection results of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid (40×)

A，pcDNA3.1-EGFP-MFN2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；B，pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達(dá)效率Western blotting檢測(cè)；C，蛋白的相對(duì)表達(dá)量A,Real-time quantitative PCR detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency;B,Western blotting detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency;C,Relative expression of protein圖4 pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達(dá)效率檢測(cè)Fig.4 Detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency

2.3 MFN2對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX表達(dá)水平的影響

2.3.1 MFN2干擾對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX表達(dá)水平的影響 布魯氏菌侵染后，siMFN2-1661組BAX的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于siMFN2-Negative組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)(圖5A)；Western blotting結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(圖5B、5C)相符，說明干擾MFN2能夠促進(jìn)布魯氏菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

A，BAX基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；B，BAX蛋白Western blotting檢測(cè)；C，蛋白的相對(duì)表達(dá)量。圖6同A,Real-time quantitative PCR detection of BAX gene;B,Western blotting detection of BAX protein;C,Relative expression of protein.The same as fig.6圖5 MFN2干擾對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX表達(dá)變化的影響Fig.5 Effects of MFN2 interference on changes in BAX expression induced by Brucella

2.3.2 MFN2過表達(dá)對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX表達(dá)水平的影響 布魯氏菌侵染后，pcDNA3.1-EGFP-MFN2組BAX的mRNA表達(dá)水平顯著低于pcDNA3.1-EGFP組(P<0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1-EGFP組BAX的mRNA表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)(圖6A)；Western blotting結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(圖6B、6C)相符，表明MFN2基因的過表達(dá)可降低布魯氏菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

圖6 MFN2過表達(dá)后對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX表達(dá)變化的影響Fig.6 Effects of MFN2 overexpression on changes in BAX expression induced by Brucella

2.4 MFN2對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 MFN2干擾對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 由圖7可知，布魯氏菌感染后，干擾組的細(xì)胞凋亡率極顯著高于siMFN2-Negative組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)(圖7)，進(jìn)一步說明干擾MFN2的表達(dá)能夠促進(jìn)布魯氏菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

A～C，分別代表未轉(zhuǎn)染組、siMFN2-Negative和siMFN2-1661組細(xì)胞凋亡流式圖；D，各組的細(xì)胞凋亡率A-C,Flow cytometry pictures of apoptosis of untransfected,siMFN2-Negative and siMFN2-1661 transfected groups,respectively;D,Apoptosis rate in each group圖7 MFN2干擾對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of MFN2 interference on Brucella induced apoptosis

2.4.2 MFN2過表達(dá)對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 由圖8可知，pcDNA3.1-EGFP-MFN2組細(xì)胞凋亡率極顯著低于pcDNA3.1-EGFP組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，pcDNA3.1-EGFP組與未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)，表明過表達(dá)MFN2基因能夠抑制布魯氏菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

A～C，分別代表未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-MFN2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡流式圖；D，各組細(xì)胞凋亡率A-C,Flow cytometry pictures of apoptosis of untransfected,pcDNA3.1-EGFP and pcDNA3.1-EGFP-MFN2 transfected groups,respectively;D,Apoptosis rate in each group圖8 MFN2過表達(dá)對(duì)布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effects of MFN2 overexpression on Brucella induced apoptosis

3 討 論

近年來，RNA干擾技術(shù)經(jīng)常被用來研究基因功能，siRNA是RNA干擾的重要中間產(chǎn)物[12]。設(shè)計(jì)合成干擾序列后，利用轉(zhuǎn)染試劑對(duì)合成的siRNA序列進(jìn)行干擾效率檢測(cè)，篩選出高效siRNA干擾序列[13]。siRNA合成方便且操作簡(jiǎn)單，是研究基因功能的有力工具[14]。本研究通過合成MFN2基因的3條siRNA干擾序列，篩選到1條干擾效率最好的siRNA-1661序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，與siMFN2-Negative組相比，siRNA-1661轉(zhuǎn)染組細(xì)胞能夠極顯著抑制MFN2 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。研究表明，病毒載體會(huì)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞增殖與分化，可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差[15]。本研究中通過構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞的方法來實(shí)現(xiàn)MFN2基因的過表達(dá)，該法簡(jiǎn)單、方便，對(duì)細(xì)胞毒性較小。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，其形態(tài)和功能的異常與細(xì)胞凋亡息息相關(guān)[16]。MFN2參與調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)，從而間接調(diào)控細(xì)胞凋亡[7-8]。研究表明，布魯氏菌感染豚鼠后會(huì)使線粒體發(fā)生斷裂及碎片化，破壞線粒體的形態(tài)[6]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，MFN2參與結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)生存機(jī)制[11]，同時(shí)與巨噬細(xì)胞的吞噬、殺菌作用緊密相關(guān)[17]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，大量研究已經(jīng)證實(shí)布魯氏菌能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡[3-4]。胞內(nèi)寄生菌抑制細(xì)胞凋亡是保證其生存、繁殖的重要策略[18]，而胞內(nèi)寄生菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡往往有利于機(jī)體將其清除[19]。通往細(xì)胞凋亡的途徑通常有3條：死亡受體途徑、線粒體凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[20]。研究表明，布魯氏菌能夠通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡線粒體途徑相關(guān)因子(如BAX、Bcl-2等)的表達(dá)來誘發(fā)凋亡[21]。BAX作為促細(xì)胞凋亡基因，其表達(dá)水平的變化可在一定程度上反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況[22]。研究發(fā)現(xiàn)，降低MFN2基因表達(dá)可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力[23]。Stavru[24]等研究表明，MFN2基因敲除會(huì)降低單增李斯特菌的胞內(nèi)存活率。 本研究中Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的MFN2干擾及過表達(dá)后布魯氏菌誘導(dǎo)的BAX mRNA和蛋白表達(dá)水平與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞凋亡結(jié)果相符，表明干擾MFN2基因可提高布魯氏菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，而過表達(dá)MFN2則抑制布魯氏菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，此結(jié)果與Lee等[11]在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的研究結(jié)果相似，可能是因?yàn)楦蓴_MFN2破壞了線粒體正常的結(jié)構(gòu)與形態(tài)，加劇了線粒體碎片化程度，損害了線粒體的功能而使細(xì)胞發(fā)生凋亡，也有可能是因?yàn)楦蓴_MFN2阻礙了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間鈣離子的正常傳遞，使線粒體鈣離子超載而凋亡，具體的機(jī)制還有待研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，干擾MFN2基因促進(jìn)布魯氏菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)MFN2基因則抑制布魯氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解MFN2基因的功能及闡明布魯氏菌的致病機(jī)制提供參考，為MFN2基因作為今后開發(fā)預(yù)防及治療布魯氏菌病方案的潛在靶點(diǎn)提供依據(jù)。