曹穎穎，李慧君，李寶瑩，梁 亮，冷 靜，唐海波

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，南寧 530200)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題，也是導(dǎo)致肝臟纖維化和肝癌的重要因素。在抗乙肝病毒治療中，目前可用的抗病毒藥物有兩類：核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素α。干擾素是一種非特異的廣譜抗病毒劑，主要通過誘導(dǎo)一系列干擾素誘導(dǎo)基因發(fā)揮抗病毒作用，雖然具有一定的抗病毒效果，但干擾素治療仍然存在著藥物副作用大、治療周期長和病毒耐藥等亟待解決的問題[1]。因此，深入研究乙肝病毒耐受干擾素導(dǎo)致慢性持續(xù)感染的分子機制、尋找潛在的新型乙型肝炎治療藥物靶點具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。干擾素作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖及免疫調(diào)節(jié)等多重作用[2-5]。當(dāng)機體識別病毒感染并快速啟動干擾素合成后，通過相關(guān)信號通路激活轉(zhuǎn)錄因子，促進干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的轉(zhuǎn)錄，最終引起數(shù)百種ISGs高表達。ISGs能參與多種生物學(xué)過程，如宿主防御、細胞凋亡、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等[6-8]，雖然很多ISGs的功能還有待挖掘，但它們在宿主抗病毒防御中的作用不容忽視。干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)編碼一種15 ku的小分子蛋白質(zhì)，在已發(fā)現(xiàn)的所有類泛素修飾蛋白中，ISG15是第一個被鑒定出的蛋白[9]。

近年來，ISG15在HBV中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ISG15酶修飾系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制過程，進而影響慢性乙型肝炎患者向肝癌的發(fā)展。Qiu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ISG15可作為HBV相關(guān)性肝細胞癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物。而HBV感染具有嚴(yán)格的種屬特異性和組織親嗜性,可用于研究的動物模型很少。目前能感染人類HBV的常用實驗動物是靈長類的黑猩猩、長臂猿等，由于其價格昂貴，一般只能用體外試驗進行研究，沒有經(jīng)濟適用的HBV感染動物模型，嚴(yán)重限制了HBV的研究進程。

樹鼩是一種最接近靈長類的動物，個體小，繁殖能力強，在生理、解剖、神經(jīng)發(fā)育、肝炎病毒感染特性及心理應(yīng)激模式等方面與靈長類甚至人類高度相似[12-13]，是目前所知的除黑猩猩、長臂猿外能感染HBV的唯一動物。本研究擬從瑤山亞種樹鼩的外周血淋巴細胞中克隆獲得ISG15基因，構(gòu)建其真核、原核表達載體并表達，通過原核表達純化樹鼩ISG15蛋白，經(jīng)免疫小鼠后獲得其多克隆抗體并鑒定其免疫原性，以期探索瑤山亞種樹鼩ISG15基因?qū)BV復(fù)制的影響，為進一步研究樹鼩的ISG15及病毒感染模型相關(guān)檢測工具提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及試驗動物 瑤山亞種樹鼩來自廣西中醫(yī)藥大學(xué)人工馴化養(yǎng)殖實驗中心；SPF級昆明小鼠(20 g±2 g)20只，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。動物均在廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室按標(biāo)準(zhǔn)方法進行飼養(yǎng)[SYXK(桂)2019-0001]。試驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查委員會審查通過(DW20201206-123)，動物使用遵循3R原則。樹鼩麻醉后靜脈取血用于外周血淋巴細胞分離。

1.1.2 主要試劑 原核載體pET-28a(+)、BHK-21細胞株、pcDNA3.1(+)和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞均由廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；淋巴細胞分離液購自Stemcell Technologies公司；Lipofectamine 2000、限制內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；pMD18-T、TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；PCR Mix酶、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；鎳柱購自GE公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自碧云天生物技術(shù)公司；馬抗鼠堿性磷酸酶抗體購自北京中衫金橋生物有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中滇西樹鼩ISG15基因預(yù)測序列(登錄號：JN866608)設(shè)計引物，上游引物ISG15-1：5′-AGACCTCAGAAGCAGCGAACT-3′；下游引物ISG15-2：5′-CCAAACCCTTCCTTACCCTC-3′，預(yù)計擴增片段長度為548 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR擴增及克隆 用TRIzol法提取樹鼩外周血淋巴細胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為下游引物進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板PCR擴增ISG15基因片段。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×TaqPCR預(yù)混劑25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

使用DNA膠回收試劑盒對鑒定正確的PCR產(chǎn)物進行回收純化，回收片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，取少量轉(zhuǎn)化菌株涂布于LA平板于37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LA平板中生長的單菌落，于 37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，菌液PCR鑒定陽性克隆質(zhì)粒，目的條帶利用DNA膠回收試劑盒回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 序列比對與氨基酸分析 將測序獲得的ISG15基因序列，與GenBank中滇西亞種樹鼩、人、黑猩猩、倭黑猩猩、獼猴、金絲猴、豬、牛、羊、貓、大鼠和小鼠的ISG15基因mRNA序列進行相似性比對及遺傳進化分析，利用DNAStar軟件中的Protean對ISG15蛋白進行氨基酸的親/疏水性和抗原性分析。

1.2.4 真核和原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)克隆測序所得的樹鼩ISG15基因序列設(shè)計真核表達引物，pcDNA3.1-ISG15U：5′-CGGATCCGCCACCA-TGGGCCGGGACTTGAAGG-3′(BamH Ⅰ)；pcDNA3.1-ISG15L：5′-CCTCGAGTTACCCTCCCCGCAGGC-GCA-3′(XhoⅠ)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.2.2獲得的陽性克隆質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系與程序同1.2.2。 用DNA膠回收試劑盒對目的條帶進行回收純化，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ于37 ℃雙酶切3 h，膠回收目的條帶和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收酶切好的目的片段和載體，二者用T4 DNA連接酶于16 ℃連接3 h，構(gòu)建pcDNA3.1-ISG15真核表達載體。連接產(chǎn)物經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，將得到的重組質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入BHK-21細胞，進行真核表達。

基于1.2.3中對ISG15基因氨基酸序列的親/疏水性和抗原性初步分析后，設(shè)計原核表達引物，pET-ISG15U：5′-CGGATCCATGGGCCGGGACT-TGAAGGT-3′(BamH Ⅰ)、pET-ISG15L：5′-CCTCGAGCCCTCCCCGCAGGCGCAAAT-3′(XhoⅠ)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.2.2獲得的陽性克隆質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，并用DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收純化，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ于37 ℃雙酶切3 h，膠回收目的條帶和pET-28a(+)質(zhì)粒，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收酶切好的目的片段和載體，二者用T4 DNA連接酶于16 ℃連接3 h，構(gòu)建pET-28a-ISG15原核表達載體。連接產(chǎn)物經(jīng)酶切及測序鑒定序列正確后，將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞[14]，進行原核表達。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 挑取轉(zhuǎn)化pET-28a-ISG15的表達菌株單菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Kan+)，37 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)；按1∶100的比例接種于50 mL LB 培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Kan+)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)約4 h使菌液D600 nm值為0.5～0.8，取1 mL菌液留樣作為誘導(dǎo)前對照；剩余菌液加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達6 h，取1 mL菌液留樣作為誘導(dǎo)后菌液，與之前取出的誘導(dǎo)前菌液用SDS-PAGE分析蛋白的表達情況[15]。

1.2.6 重組蛋白ISG15的純化及鑒定

1.2.6.1 重組蛋白表達形式檢測 重組蛋白經(jīng)鑒定正確后進行大量誘導(dǎo)表達獲取目的蛋白。按誘導(dǎo)表達步驟誘導(dǎo)表達1 000 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，棄上清后收集菌體，按每克濕菌加10 mL裂菌緩沖液重懸菌體，于液氮中反復(fù)凍融3～4次后，置于低溫環(huán)境超聲裂解30 min破碎細菌細胞。裂解產(chǎn)物以4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取適量裂解產(chǎn)物的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析蛋白表達形式[16]。

1.2.6.2 包涵體的純化 重組蛋白融合了pET-28a(+)載體上帶有的多聚組氨酸(6×His)標(biāo)簽，利用Ni2+金屬鰲合親和層析法進行純化。蛋白用包涵體溶解液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素)溶解后，暴露出6×His標(biāo)簽，再與3 mL Ni-NTA樹脂充分混勻并室溫結(jié)合30 min，按說明書操作收集洗脫蛋白，進行SDS-PAGE電泳分析純化情況，并將包涵體利用梯度遞降尿素濃度透析的方法進行復(fù)性，復(fù)性好的蛋白用超微量分光光度計檢測濃度后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.3 重組蛋白的鑒定 利用Western blotting檢測重組蛋白。純化復(fù)性后的ISG15重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以鼠抗His標(biāo)簽抗體為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色觀察。

1.2.7 抗體制備及反應(yīng)性檢測 將弗氏佐劑與純化復(fù)性后的ISG15蛋白(100 μg/只)乳化后免疫昆明小鼠，免疫周期為第1、7、28、35和45天，免疫方式為背部皮下多點注射。首次免疫用弗氏完全佐劑與ISG15乳化，第2、3、4、5次免疫用弗氏不完全佐劑與ISG15乳化。第5次免疫后1周小鼠摘眼球取血并處死，分離血清，Western blotting和間接免疫熒光技術(shù)(IFA)檢測多克隆抗體的反應(yīng)性。Western blotting試驗：以不同稀釋度的抗ISG15多克隆抗體為一抗，未免疫小鼠血清為陰性對照，堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色觀察。IFA試驗：用轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ISG15真核表達載體24 h后的單層BHK-21細胞，按1∶100分別稀釋制備的抗ISG15多克隆抗體和未免疫小鼠陰性血清作為一抗，以1∶300稀釋FITC標(biāo)記的馬抗小鼠IgG作為二抗，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 ISG15基因PCR擴增與相似性分析

提取瑤山亞種樹鼩外周血淋巴細胞總RNA，RT-PCR擴增得到548 bp的ISG15基因片段(圖1A)，與預(yù)期片段大小相符。將ISG15基因克隆后進行菌液PCR檢測，電泳結(jié)果顯示有目的條帶，證明ISG15基因已成功克隆到pMD18-T載體上(圖1B)。對陽性克隆質(zhì)粒測序分析發(fā)現(xiàn)，與GenBank中滇西亞種樹鼩ISG15基因mRNA序列相似性為99.6%，與人、猩猩及猴的相似性較高，為78.1%～78.7%(圖2)。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，瑤山亞種樹鼩與人、猩猩及猴的親緣關(guān)系較近(圖3)，這一結(jié)果與相似性分析結(jié)果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，樹鼩ISG15基因PCR擴增；3、6，陰性對照；4、5，樹鼩ISG15基因克隆菌液PCR擴增M，DL2000 DNA Marker;1 and 2，PCR amplification of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis;3 and 6，Negative control；4 and 5，PCR amplification of clony bacterial fluid of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis圖1 樹鼩ISG15基因PCR擴增(A)和克隆鑒定(B)Fig.1 PCR amplification (A) and colony identification (B) of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

圖2 瑤山亞種樹鼩ISG15基因相似性比對Fig.2 Similarity alignment of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

圖3 瑤山亞種樹鼩ISG15基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

2.2 ISG15氨基酸序列分析

利用DNAStar軟件分析瑤山亞種樹鼩ISG15蛋白的結(jié)構(gòu)，包括N-端和C-端，結(jié)果顯示，該蛋白富含親水性氨基酸，疏水性氨基酸整體較少，只出現(xiàn)在中間的個別肽段位置(圖4)。

圖4 瑤山亞種樹鼩ISG15蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Structure analysis of ISG15 protein in T.b.yaoshanensis

2.3 ISG15基因真核及原核表達載體的構(gòu)建

分別構(gòu)建瑤山亞種樹鼩ISG15基因的真核及原核表達載體。真核表達載體pcDNA3.1-ISG15和原核表達載體pET-28a-ISG15經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定，菌液PCR圖中在500 bp左右出現(xiàn)目的條帶(圖5A、6A)，酶切鑒定圖中在約500和5 000 bp處出現(xiàn)目的條帶和載體條帶(圖5B、6B)，初步鑒定結(jié)果顯示質(zhì)粒為陽性。經(jīng)測序分析，pcDNA3.1-ISG15真核表達載體和pET-28a-ISG15原核表達載體讀碼正確，未發(fā)生錯位，表明真核及原核表達載體構(gòu)建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1、2，菌液中ISG15基因的PCR產(chǎn)物；M2，DL10000 DNA Marker；3、4,重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ISG15的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切結(jié)果M1，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of ISG15 gene in bacterial liquid；M2，DL10000 DNA Marker；3 and 4，Recombinant plasmid pcDNA3.1-ISG15 by the restriction digestion with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ圖5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ISG15菌液PCR(A)及雙酶切(B)鑒定Fig.5 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-ISG15 by bacterial liquid PCR (A) and double enzymes digestion (B)

2.4 ISG15重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化鑒定及多克隆抗體制備

將重組質(zhì)粒pET-28a-ISG15轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞并誘導(dǎo)表達，最終以30 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h獲得高表達(圖7A)，主要在超聲波破碎細菌后的沉淀中檢測到重組ISG15蛋白(22 ku)(圖7B)，說明蛋白主要以包涵體的形式表達。重組蛋白經(jīng)過Ni2+親和層析純化后得到雜蛋白較少、濃度較高的ISG15蛋白(圖7C)。經(jīng)過純化后復(fù)性并濃縮的重組蛋白濃度為4.1 mg/mL。

M1，DL2000 DNA Marker；1，菌液中ISG15基因的PCR產(chǎn)物；M2，DL10000 DNA Marker；2，重組質(zhì)粒pET-28a-ISG15的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切結(jié)果M，DL2000 DNA Marker；1，PCR products of ISG15 gene in bacterial liquid；M2，DL10000 DNA Marker；2，Recombinant plasmid pET-28a-ISG15 by the restriction digestion with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ圖6 重組質(zhì)粒pET-28a-ISG15菌液PCR(A)及雙酶切(B)鑒定Fig.6 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-ISG15 by bacterial liquid PCR (A) and double enzymes digestion (B)

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、5，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h重組菌ISG15蛋白；2、4、未誘導(dǎo)重組菌；3,0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h的pET-28a(+)；6，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后重組菌裂解菌體的上清；7，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后重組菌裂解菌體的沉淀；8，穿透液；9，洗滌液1；10，洗滌液2；11，洗脫液1；12，洗脫液2M,Protein Marker；1 and 5,ISG15 protein induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；2 and 4,Uninduced recombinant bacteria；3,The pET-28a(+) induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；6，The supernatant of the recombinant bacteria induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；7，The sediment of the recombinant bacteria induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；8，Penetration fluid；9，Detergent 1；10，Detergent 2；11，Elution 1；12，Elution 2圖7 ISG15蛋白原核表達(A)、表達形式(B)及純化(C)鑒定Fig.7 Identification of prokaryotic expression (A)，expression form (B) and purification (C) of ISG15 protein

Western blotting鑒定結(jié)果表明，純化的重組蛋白帶有His標(biāo)簽(圖8)，與預(yù)測的蛋白加標(biāo)簽蛋白大小基本一致，表明ISG15蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中正確表達。以復(fù)性后的ISG15重組蛋白制備抗原免疫昆明小鼠，免疫程序結(jié)束后1周采血分離血清，所得血清即為鼠源樹鼩ISG15多克隆抗體。利用Western blotting方法檢測抗體的反應(yīng)性，結(jié)果顯示,制備的多克隆抗體在稀釋度為1∶8 000時仍能夠與0.01 μg的ISG15重組蛋白結(jié)合，與抗His標(biāo)簽單克隆抗體相比，制備的ISG15多克隆抗體反應(yīng)性良好。

①A，His抗體稀釋度1∶2 000；B，His抗體稀釋度1∶4 000。②M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4，抗原上樣量分別為1、0.1、0.01和0.001 μg①A，The His antibody dilution was 1∶2 000；B，The His antibody dilution was 1∶4 000.②M,Protein Marker;1-4,The loading amount of antigen was 1,0.1,0.01 and 0.001 μg,respectively圖8 His標(biāo)簽鑒定ISG15蛋白Fig.8 Identification of ISG15 protein by His tag

2.5 間接免疫熒光技術(shù)驗證抗體的反應(yīng)性

由圖9可知，在轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-ISG15的BHK-21細胞上孵育制備的ISG15多克隆抗體均出現(xiàn)了特異性綠色熒光，分布于細胞核及細胞漿中，有成小團狀聚集或均質(zhì)分布，而用陰性血清孵育的相同轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞則無特異性熒光。

A，pcDNA3.1-ISG15真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后用抗ISG15多克隆抗體孵育；B，pcDNA3.1-ISG15真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后用陰性血清孵育A，The BHK-21 cells transfected with pcDNA3.1-ISG15 eukaryotic expression vector were incubated with anti-ISG15 polyclonal antibody;B，The BHK-21 cells transfected with pcDNA3.1-ISG15 eukaryotic expression vector were incubated with negative serum圖9 間接免疫熒光檢測多克隆抗體的反應(yīng)性(400×)Fig.9 Reactivity of polyclonal antibody by indirect immunofluorescence analysis (400×)

3 討 論

樹鼩是一種外形與松鼠類似的遺傳上最接近靈長類的動物，其作為新興實驗動物，在病毒感染模型方面相較于嚙齒類實驗動物有著不可替代的作用。研究認為，樹鼩是靈長類動物的近親，在生理機能、生化代謝和基因組等方面與人相似，而遠高于小鼠、大鼠等常用嚙齒類實驗動物[13]；樹鼩能被多種與人類疾病有關(guān)的病毒感染[17-19]；與靈長類實驗動物相比，樹鼩具有體型小、繁殖快、成本低等特點，因此，樹鼩在醫(yī)學(xué)研究中的價值受到越來越多的關(guān)注。目前，學(xué)者對樹鼩的解剖學(xué)、生殖生理學(xué)、腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)、動物模型等方面已進行了大量的研究[20-25]，且有了較為全面和深入的了解。在病毒學(xué)方面，樹鼩成為研究如肝炎病毒和輪狀病毒等感染和致病機制的理想動物模型，但還存在一些問題，尤其是樹鼩免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答相關(guān)細胞因子等研究相對匱乏，也缺乏樹鼩特異性抗體等生物制劑，使流式細胞術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)等難以開展，嚴(yán)重限制了病毒感染動物模型在相關(guān)研究上的應(yīng)用。

3.1 樹鼩ISG15基因的克隆與表達系統(tǒng)的構(gòu)建

本研究通過RT-PCR擴增獲得了瑤山亞種樹鼩ISG15基因，長548 bp，與GenBank中登錄的人、黑猩猩、倭黑猩猩、獼猴、金絲猴、家豬、牛、羊、貓、大鼠和小鼠等ISG15基因mRNA序列進行相似性比對，結(jié)果顯示，樹鼩ISG15基因與人、猩猩及猴等相似性較高，為78.1%～78.7%，高于大鼠、小鼠與人、猩猩及猴的相似性(70.8%～73.9%)。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，瑤山亞種樹鼩ISG15基因與人和猴親緣關(guān)系更加接近，和人、猴等共同組成的大分支與大鼠、小鼠等組成的大分支以及牛、羊等組成的大分支三者處于平行位置，所以樹鼩ISG15基因在遺傳水平上與人和獼猴等關(guān)系更加密切，進一步驗證了其進化上的優(yōu)勢。

由于真核表達可反映ISG15蛋白在哺乳動物細胞中的自然折疊及構(gòu)象等，能觀察到其空間分布及定位，本研究構(gòu)建了pcDNA3.1-ISG15真核表達載體，并轉(zhuǎn)染BHK-21細胞進行蛋白過表達，構(gòu)建的真核表達載體得到了很好的表達，為后期進行樹鼩ISG15蛋白的功能性研究奠定基礎(chǔ)。

原核表達重組蛋白具有操作相對簡單、蛋白表達量高、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，因此本研究采用pET系統(tǒng)載體誘導(dǎo)表達瑤山亞種樹鼩ISG15蛋白。將克隆測序得到的ISG15基因翻譯成氨基酸序列后利用DNAStar分析氨基酸的親/疏水性與抗原性，結(jié)果表明，ISG15整體片段的親水性與抗原性良好，沒有連續(xù)長片段的疏水氨基酸，因此嘗試構(gòu)建包含整個ISG15基因ORF的原核表達載體。結(jié)果顯示，構(gòu)建的原核表達載體一次性表達成功，誘導(dǎo)原核表達的試驗中改變了各種誘導(dǎo)表達的條件，雖然有少量蛋白以可溶性的形式表達，但其產(chǎn)量遠遠低于包涵體形式的表達量。

3.2 ISG15蛋白純化與多克隆抗體制備

在蛋白純化方面，重組蛋白融合了pET-28a(+)載體上帶有的6×His標(biāo)簽，蛋白使用含有高濃度尿素的包涵體溶解液溶解后，二級結(jié)構(gòu)暴露較好，過鎳柱時重組蛋白His組氨酸標(biāo)簽與鎳離子較充分地鰲合，蛋白掛柱成功。利用遞降pH的洗脫緩沖液洗脫回收目的蛋白，洗脫液中雜蛋白較少，重組蛋白濃度較高，獲得了較優(yōu)良的ISG15蛋白。由于使用高濃度尿素的包涵體溶解液溶解包涵體，因此純化得到的蛋白是變性蛋白而沒有活性，需要對其進行復(fù)性和重新折疊。本研究采用逐步透析法不斷降低變性劑中尿素濃度來復(fù)性蛋白的策略，在透析液中加入甘油、精氨酸來抑制聚集和促進蛋白天然構(gòu)象形成，加入氧化/還原型谷胱甘肽促進蛋白構(gòu)象還原鍵的形成，結(jié)果證實，純化蛋白經(jīng)過透析復(fù)性之后免疫原性及活性完好。提示富含親水性氨基酸肽段，不一定以可溶性的形式表達，也可能是以包涵體的形式表達，與理論預(yù)測不一致，但總體上富含親水性氨基酸的蛋白更容易表達與純化，與Ni2+金屬鰲合后再洗滌與洗脫，可得到較純的目的蛋白。同時如果得到的蛋白濃度較低，可以在蛋白復(fù)性透析后用PEG20000在4 ℃條件下進行濃縮，提高蛋白的濃度。ISG15重組蛋白經(jīng)乳化后免疫小鼠，成功獲得了小鼠抗樹鼩ISG15多克隆抗體，Western blotting和IFA試驗顯示了該抗體具有良好的反應(yīng)性，為研究樹鼩抗病毒作用機制等奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗成功克隆瑤山亞種樹鼩ISG15基因，并構(gòu)建了其真核和原核表達載體，真核表達載體在BHK-21細胞中能高效表達；通過原核表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中成功表達瑤山亞種樹鼩ISG15蛋白，復(fù)性后的重組蛋白具有良好反應(yīng)性和免疫原性，免疫小鼠獲得的ISG15多克隆抗體具有良好反應(yīng)性。