汪祥燕，辛國芹，徐海燕，谷 巍，蘭江華，郝木強，馮 剛

(1.山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000；2.唐山動物園動物醫(yī)院，唐山 063000)

動物在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生許多自由基，當動物機體細胞內(nèi)產(chǎn)生自由基的水平高于細胞的抗氧化防御能力時，氧化還原狀態(tài)會失衡，過量的自由基積存在組織或細胞內(nèi)，進而誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷。動物腸道作為機體吸收營養(yǎng)、屏障病原體最為重要的器官，也是最易受到氧化應(yīng)激危害的器官，腸道的氧化損傷將直接影響到動物機體的生長發(fā)育及健康狀況，導(dǎo)致動物采食量下降、生長發(fā)育和抗病力降低，種畜繁殖障礙、幼畜成活率低，疾病多發(fā)，死亡率增高，且畜產(chǎn)品品質(zhì)顯著降低[1-2]。在動物養(yǎng)殖過程中，由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的動物疾病有心臟病、腎臟病、腹水癥、圍產(chǎn)期疾病、乳房炎、消化道炎癥等，已嚴重影響了畜牧業(yè)的生產(chǎn)[3]。

研究證明，乳酸菌在體外具有類似抗氧化劑的活性，在體內(nèi)攝入乳酸菌對機體或細胞的氧化應(yīng)激具有顯著的調(diào)節(jié)作用[4-5]。目前報道的抗氧化乳酸菌的篩選方法較多，包含評定菌株清除DPPH自由基(DPPH·)、羥自由基(HO·)和超氧自由基的能力、抗亞油酸能力、還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力等[6-8]。以這些評價指標為基礎(chǔ)建立的乳酸菌篩選方法，測定過程復(fù)雜、工作量大，且菌株間性能難以比較，且由于各種評價指標測定方法的機理不同，采用某種指標來篩選高抗氧化活性的乳酸菌菌株有一定的局限性。鑒于此，本試驗以體外耐受過氧化氫氧化脅迫方法進行初篩，以體外對過氧化氫的耐受能力進行復(fù)篩，篩選具有潛在抗氧化能力的乳酸菌，并采用多種方法對篩選菌株體外抗氧化能力進行評價，綜合確定優(yōu)選菌株，為新型抗氧化微生態(tài)制劑、緩解畜禽養(yǎng)殖過程中的氧化應(yīng)激提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 試驗所用27株菌全部由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心提供，分別由動物腸道、青貯料、泡菜等分離源分離純化得到，詳細信息見表1。

表1 試驗所用菌株

1.1.2 主要試劑與儀器 總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀5 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、吐溫-80 1 g/L，pH 6.0，121 ℃滅菌30 min(所用試劑均為國產(chǎn)分析純)。

SHP-150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、潔凈工作臺(SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、紫外分光光度計(UV-8000，上海元析儀器有限公司)、pH計(PB-10，德國賽多利斯集團)、立式壓力蒸汽滅菌器(YM 50，上海三申醫(yī)療器械有限公司)及高速冷凍離心機(Biofuge Stratos，賽默飛世爾科技公司)等。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性乳酸菌的篩選

1.2.1.1 初篩 以體外耐受過氧化氫氧化脅迫方法進行初篩，具體方法為：在滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中添加過氧化氫溶液，使培養(yǎng)基中起始過氧化氫濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L。將菌體濃度為1×109CFU/mL的乳酸菌菌液按5%的接種量接種到含不同濃度過氧化氫的液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)15～18 h，用分光光度計測定菌液D600 nm值[9]。 通過計算0與2.0 mmol/L過氧化氫的D600 nm值差，進行抗氧化乳酸菌的初步篩選。

1.2.1.2 復(fù)篩 以體外對過氧化氫的耐受存活率為指標進行復(fù)篩，具體方法為：將乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，用PBS洗滌并制備5×108CFU/mL的菌液；取1.0 mL菌液， 加入4.0 mL含有2.5 mmol/L過氧化氫的PBS中。37 ℃處理20 min，再加入0.2 mg/mL過氧化氫酶終止過氧化氫對菌體的作用，然后采用標準平板計數(shù)法對樣品中殘存的細胞計數(shù)，并根據(jù)初始活菌數(shù)計算存活率。

1.2.2 乳酸菌的體外抗氧化功能評價

1.2.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)及樣品的制備 菌體培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，所有的菌株經(jīng)過3次傳代。測定培養(yǎng)上清液(cell-free supernatants,CFS)、菌體細胞(intact cells,IC)及無細胞提取物(cell-free extracts,CFE)抗氧化性能指標，綜合評價菌株的抗氧化能力，同時設(shè)置0.01%維生素C(VC)作對照。培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，分別收集CFS和菌體沉淀；菌體沉淀用PBS洗滌3次，重懸浮于PBS，調(diào)整活菌數(shù)到109CFU/mL；所有菌懸液分為兩組，一組為IC組，另一組用于CFE的制備：冰浴超聲破碎細胞后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清即為CFE。

1.2.2.2 清除DPPH·能力的測定 參照王曦等[10]方法測定乳酸菌DPPH·清除能力，按公式(1)計算：

(1)

式中：A1，1 mL DPPH與1 mL樣品反應(yīng)的D517 nm值；A2，1 mL無水乙醇與1 mL樣品反應(yīng)的D517 nm值；A3，1 mL DPPH與1 mL PBS反應(yīng)的D517 nm值。

1.2.2.3 清除HO·能力的測定 參照張江巍等[11]方法測定乳酸菌HO·清除能力，按公式(2)計算：

(2)

式中：A0，反應(yīng)中不含樣品和過氧化氫時的D536 nm值；A1，反應(yīng)中不含樣品但含過氧化氫時的D536 nm值；A2，反應(yīng)中含樣品和過氧化氫時的D536 nm值。

1.2.2.4 還原活性的測定 參照顧品品等[12]方法測定乳酸菌的還原活性，乳酸菌樣品的還原活性以對應(yīng)的L-半胱氨酸鹽酸鹽的量來表示(μmol/L)。

1.2.2.5 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定 參照張江巍等[11]方法測定乳酸菌的抗脂質(zhì)過氧化能力，按公式(3)計算：

(3)

式中:A樣品、A空白分別為樣品及PBS反應(yīng)時D532 nm值。

1.2.2.6 T-SOD活性及T-AOC測定 按照試劑盒說明書步驟測定乳酸菌樣品的T-SOD活性及T-AOC。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 16S rDNA擴增與序列分析 參照汪祥燕等[13]方法對乳酸菌進行16S rDNA擴增與序列分析，PCR產(chǎn)物送至北京鉑尚生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 登錄NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)對菌株16S rDNA測序結(jié)果利用BLAST進行檢索，并下載相關(guān)屬種的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、Mega 5.2等軟件進行相似性分析后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件中One-Way ANOVA程序?qū)θ樗峋w外抗氧化性能指標進行方差分析，用t檢驗進行組間比較，結(jié)果以平均值±標準差表示。 以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 抗氧化乳酸菌的初篩

27株乳酸菌在不同濃度過氧化氫體系的D600 nm值見表2。由表2可知，隨著過氧化氫濃度的增大，菌株的吸光值有不同程度降低。與0 mmol/L組相比，2.0 mmol/L組有19株乳酸菌D600 nm值顯著降低(P<0.05)，8株乳酸菌無顯著差異(P>0.05)。因此，選取這8株菌進行下一步的復(fù)篩，它們分別為C2-0126、C2-0028、C2-0327、C2-0310、C2-0011、C2-0020、C2-0021及C2-0108。

表2 菌株在不同濃度過氧化氫體系的D600 nm值

2.2 抗氧化乳酸菌的復(fù)篩

由表3可知，8株乳酸菌在37 ℃、2.0 mmol/L過氧化氫中孵育20 min后耐受存活率差異較大。其中，乳酸菌C2-0020、C2-0126及C2-0327存活率在80%以上，且C2-0327耐受過氧化氫存活率最高，為95.3%。選取這3株菌進行下一步體外抗氧化性能評價。

表3 菌株在2.0 mmol/L過氧化氫體系下的活菌數(shù)及存活率

2.3 乳酸菌抗氧化性能評價

分別測定3株強耐受過氧化氫乳酸菌CFS、IC及CFE抗氧化性能指標，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，3株乳酸菌CFS DPPH·清除率均較高，與0.01% VC清除效果(95.3%)相當;由圖1B可知，C2-0327及C2-0126 IC對HO·清除率較高(140%左右)，均顯著高于C2-0020(P<0.05)，且均顯著高于0.01% VC(6.4%)(P<0.05);由圖1C可知，3株乳酸菌CFS的L-半胱氨酸當量由高到低為：C2-0020>C2-0327>C2-0126，分別為3 159、 3 147及2 977.5 μmol/L，均顯著高于0.01% VC(902 μmol/L)(P<0.05);由圖1D可知，3株乳酸菌CFS的抗脂質(zhì)過氧化率由高到低為：C2-0327>C2-0020>C2-0126，其中C2-0327的抗脂質(zhì)過氧化率顯著高于0.01%VC(32.6%)(P<0.05)，且C2-0327的IC和CFE也有較高的抗脂質(zhì)過氧化能力。

相同培養(yǎng)液組分，肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同In the same culture components,values with different letter superscripts mean significant (P<0.05);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 乳酸菌體外抗氧化性能指標測定結(jié)果Fig.1 Determination results of antioxidant capacity indexes of lactic acid bacteria in vitro

由圖2A可知，C2-0327菌株CFS的T-SOD活性達81.32 U/mL，顯著高于菌株C2-0126、C2-0020(P<0.05);由圖2B可知，3株乳酸菌CFS T-AOC均較高，由高到低分別為C2-0327、C2-0126、C2-0020，T-AOC分別為20.10、18.99、18.94 U/mL。

圖2 乳酸菌總超氧化物歧化酶活性(A)及總抗氧化能力(B)Fig.2 Total superoxide dismutase activity (A) and total antioxidant capacity (B) of lactic acid bacteria

綜合以上6項體外抗氧化性能指標的測定結(jié)果，菌株C2-0327抗氧化性能最優(yōu)，對其進行菌種鑒定。

2.4 菌種鑒定

挑取菌株C2-0327純培養(yǎng)物種接于MRS培養(yǎng)基平皿，37 ℃培養(yǎng)48 h后形成乳白色圓形菌落，光滑，凸起，邊緣整齊，不透明。革蘭氏染色為陽性。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌體細胞呈球狀，不形成芽孢。

由16S rDNA測序結(jié)果可知，乳酸菌C2-0327的序列長度為1 441 bp。將該序列在NCBI中進行BLAST比對，并從中調(diào)取、下載與菌株C2-0327相似性較高的和該屬內(nèi)其他相關(guān)菌株的16S rDNA，利用Mega 5.2軟件的Neighboring-Joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。由圖3可知，菌株C2-0327與已知戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)的16S rDNA序列相似度為100%。綜合菌落及菌體形態(tài)，菌株C2-0327鑒定為戊糖片球菌。

圖3 菌株C2-0327與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree between C2-0327 and related strains

3 討 論

3.1 抗氧化乳酸菌的篩選

過氧化氫作為HO·的前體參與氧化過程，以體外對過氧化氫的耐受能力作為抗氧化乳酸菌的篩選指標，簡便高效，且菌株間易比較。 張江巍等[11]試驗結(jié)果顯示，當用2 000 mg/L過氧化氫在37 ℃處理1 min后，乳酸菌L3、L4的存活率僅有40%和70%，保加利亞乳桿菌的存活率僅有20%。田豐偉[14]試驗結(jié)果顯示，169株乳酸菌在0.5 mmol/L過氧化氫溶液中孵育1 min后菌株存活率在10%以上的菌株僅32株；這些菌株在0.5 mmol/L過氧化氫中處理10 min后存活率在50%以上的僅6株，最高存活率為80%，在2.0 mmol/L過氧化氫中處理10 min后僅有4株菌存活，存活率為1.5%～55%。王悅齊等[15]研究結(jié)果顯示，菌體起始濃度為1.0×109CFU/mL、過氧化氫體積分數(shù)為0.25%、37 ℃僅處理1 min后，抗氧化性能較好的戊糖片球菌L4存活率在85%左右。本試驗通過測定菌株對過氧化氫的耐受能力，對抗氧化菌株進行快速篩選，從27株乳酸菌中篩選出3株強抗氧化乳酸菌，在2.0 mmol/L過氧化氫、37 ℃條件下孵育20 min后菌株存活率較高，分別為95.3%、82.6%及80.2%，與已報道文獻相比，耐受過氧化氫能力處于較高水平。

3.2 乳酸菌的體外抗氧化能力

乳酸菌具有抗氧化作用，但菌株之間的抗氧化活性具有較大的差異，同一菌株不同組分的抗氧化能力也不同。本試驗篩選菌株的DPPH·清除功能主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中，而其IC和CFE也可起到一定的DPPH·清除作用；篩選菌株的HO·清除功能主要存在于其完整菌體中，而其胞內(nèi)和胞外代謝產(chǎn)物也可起到一定的HO·清除作用，這與劉亞東等[16]的結(jié)論相同，即不同菌株間清除自由基能力的差異可能是因為其胞外多糖和胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)、硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷胱甘肽系統(tǒng)、巰基氧化還原系統(tǒng)等差異造成的。王惠等[17]試驗中12株乳酸菌無菌體發(fā)酵液均具有較好的清除DPPH·能力，其清除能力在59.98%～71.23%之間，而細胞菌懸液的HO·清除能力強于無菌體發(fā)酵液。王惋等[18]結(jié)果顯示，菌株A15完整細胞懸液的HO·清除率為39%。本試驗篩選菌株的還原活性及抗脂質(zhì)過氧化活性物質(zhì)很可能主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中，而其IC和CFE也可起到一定的還原活性，這與王英等[19]結(jié)論一致，在王英等[19]研究中，不同菌株之間的還原活性差異顯著，還原活性在34.84～284.02 μmol/L(以L-半胱氨酸當量計)，菌株脂質(zhì)過氧化抑制率最高為68.88%。張江巍等[11]在抗亞油酸過氧化試驗中發(fā)現(xiàn)，有27株乳酸菌對亞油酸過氧化有抑制作用，抑制率的范圍為4.9%～75.2%。此外，有些乳酸菌在發(fā)酵過程中還能分泌具有抗氧化性能的酶類，如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等[20]，且可用T-AOC評價其抗氧化功能。本試驗篩選菌株的T-SOD活性及T-AOC很可能主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中。目前對乳酸菌抗氧化能力的研究和利用多是針對菌體細胞及無細胞提取物，然而本研究表明，乳酸菌抗氧化活性物質(zhì)較多分布在胞外分泌物中。

乳酸菌作為一種天然的抗氧化劑，具有安全、無毒副作用、穩(wěn)定、增強機體免疫力等重要優(yōu)勢。常見的抗氧化活性乳酸菌主要有發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌等[21-23]，不同乳酸菌菌株的抗氧化能力存在很大差異，可能是不同乳酸菌分泌的抗氧化物質(zhì)的種類、數(shù)量及濃度的差異所致。本試驗通過耐受過氧化氫脅迫篩選及多種方法綜合評價得到的高抗氧化活性乳酸菌為戊糖片球菌，抗氧化活性物質(zhì)較多分布在胞外分泌物中。后期將在本研究的基礎(chǔ)上針對戊糖片球菌C2-0327體內(nèi)抗氧化性能、抗氧化物質(zhì)及抗氧化的分子調(diào)控機制展開進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過耐受過氧化氫脅迫篩選及多種體外抗氧化能力綜合評價，篩選到1株高抗氧化活性戊糖片球菌C2-0327，其對2.0 mmol/L過氧化氫的耐受存活率為95.3%，其抗氧化活性物質(zhì)較多分布在胞外分泌物中。