沈曄 李茜 鄭悅亮 韓楠楠 陳環(huán) 王圣果

[摘要] 目的 通過氣管內滴注脂多糖建立小鼠急性肺損傷模型，探討黃芪對急性肺損傷的保護作用及其療效評估。方法 將小鼠隨機分為正常對照組（氣管內滴注無菌PBS 60 μl）、模型組（LPS組，氣管內滴注0.5 mg/kg，LPS 100 μl，作用24 h）、黃芪治療組（0.75 g/L RA+LPS組），觀察小鼠肺組織病理學改變、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細胞計數變化、測定蛋白含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。分離肺組織以評估濕/干重比，Western blot 法檢測促炎細胞因子的mRNA表達和組織學變化。 結果 與模型組相比，黃芪治療組BALF中總細胞數及蛋白質含量比值明顯降低（P<0.01）;黃芪治療組小鼠右肺中葉W/D比值明顯降低（P<0.01）;小鼠血清SOD活性含量明顯高于模型組（P<0.01）。在肺泡灌洗液檢測中發(fā)現，與模型組相比，黃芪治療組TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。病理組織學提示黃芪治療組可顯著減輕肺組織損傷。 結論 黃芪能夠顯著減輕LPS誘導的肺部炎癥，對小鼠急性肺損傷有很強的保護作用。

[關鍵詞] 急性肺損傷;黃芪：脂多糖;炎癥細胞遷移

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）01-0038-04

Study on the mechanism of radix astragali on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice

SHEN Ye1? ?LI Qian1? ?ZHENG Yueliang1? ?HAN Nannan1? ?CHEN Huan1? ?WANG Shengguo2

1.Department of Emergency Medicine， Zhejiang Provincial People′s Hospital， Hangzhou? ?310014， China; 2.Department of Emergency， the First People′s Hospital of Jiashan County in Zhejiang Province， Jiashan? ?314100， China

[Abstract] Objective To establish a mouse model of acute lung injury by intratracheal instillation of lipopolysaccharide， and to explore the protective effect of radix astragali on acute lung injury and the evaluation of curative effect. Methods The mice were randomly divided into the normal control group （intratracheal instillation of 60 μl of sterile PBS）， the model group （LPS group， intratracheal instillation of 0.5 mg/kg， 100 μl of LPS for 24 h） and the radix astragali treatment group （0.75 g/L RA+LPS group）. The histopathological changes of lung tissue， the changes of cell count in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were observed. The protein content and the activity of superoxide dismutase （SOD） were measured. Lung tissues were isolated to assess the wet/dry weight ratio.The mRNA expression and histological changes of proinflammatory cytokines were detected by Western blot. Results Compared with LPS model group， the total cell count and protein content ratio in BALF of radix astragali treatment group were significantly decreased（P<0.01）. The W/D ratio in the right middle lobe of mice in radix astragali treatment group was significantly decreased（P<0.01）. The SOD activity content in serum of mice in radix astragali treatment group was significantly higher than that of LPS group（P<0.01）. The bronchoalveolar lavage fluid examination found that the contents of TNF-α， IL-1β， and IL-6 were significantly lower in the radix astragali treatment group compared with the model group（P<0.01）， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Histopathology suggested that the astragalus treatment group significantly reduced lung tissue injury. Conclusion Radix astragali can significantly reduce LPS-induced pulmonary inflammation and has a strong protective effect on acute lung injury in mice.

[Key words] Acute lung injury; Radix astragali; Lipopolysaccharide; Inflammatory cell migration

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由各種肺內外因素致血管通透性持續(xù)增加、彌漫性肺臟炎癥損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征[1]。革蘭陰性細菌感染作為ALI發(fā)生的重要原因之一，其主要的的致病成分脂多糖（LPS）可誘導顯著的氧化應激和炎癥反應，此二者被認為在ALI發(fā)病機制中居重要地位[2]。因此，靶向控制氧化應激和炎癥應答的治療手段有可能為臨床防治ALI提供新的思路。黃芪（radix astragali，RA）是我國傳統(tǒng)中草藥，最早記載于《神農本草經》，屬用藥上品，具有益氣、祛邪、扶正，歸脾、肺經，補氣升陽、益衛(wèi)固表之功效[3]。RA具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑菌，心臟神經保護作用等[3]。本實驗擬通過觀察RA對LPS致小鼠肺損傷后肺組織病理性變化、肺泡灌洗液中細胞計數變化、炎癥因子表達的變化，探索其對急性肺損傷的保護作用，為臨床治療提供實驗依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 試劑? LPS（Sigma Chemical公司）;Trizol分離試劑（Invitrogen公司）;IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒（上海斯信生物科技股份有限公司）;實時熒光定量PCR試劑（杭州博日科技有限公司）;MPO、SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。黃芪購買于本院中醫(yī)藥庫。

1.1.2 動物實驗? 健康雄性SOD小鼠60只，體重150～200 g。本動物實驗在浙江省中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行。動物許可證號：SYXK（浙）2018-0012。所有的操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。動物在實驗前自由進食和進水。將RA以10 mmol/L溶解于DMSO中作為儲備濃度。在使用前立即將過硫酸銨（APS）原液稀釋于無菌生理鹽水中（最終DMSO濃度為0.1%）。根據文獻本研究選擇質量濃度0.75 g/L作為RA的最終劑量。

1.2 方法

1.2.1 ALI小鼠模型建立和實驗方案? 將小鼠隨機分成：正常對照組（NS組）、模型組（LPS組）、黃芪治療組（RA組）和地塞米松陽性對照組（DEX組，5 mg/kg）四組，每組12只。黃芪治療組小鼠分別予按千克體重15 mL黃芪提取物懸濁液（體重濃度0.75 g/L）進行灌胃，1次/d。模型組、正常對照組給予等量生理鹽水灌胃。地塞米松陽性對照組在造模前1 h給予地塞米松5 mg/kg灌胃，連續(xù)灌胃30 d。第31天，除正常對照組外，其余各組小鼠均經腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液[80 mg/（kg·bw）]麻醉，采用經口氣管插管后氣道內滴入LPS（0.5 mg/kg，100 μL）建立小鼠ALI模型[4]。

1.2.2 組織病理學分析? HE染色小鼠肺組織及病理評分，并測定小鼠肺組織濕/干重比：造模24 h后將小鼠麻醉后股動脈放血處死，暴露氣管，結扎左肺，用 4%多聚甲醛固定左肺組織樣本24 h，采用乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm）。切片進行HE染色后并進行肺組織學檢查;取右肺稱重（濕重），置60℃烘箱48 h后稱干重，肺濕重/干重比值代表了肺水含量，根據（濕重-干重）/濕重公式計算肺水含量。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液分析? 提取肺泡灌洗液，檢測小鼠BALF中總蛋白及LDH的水平，并檢測小鼠BALF中細胞總數、中性粒細胞數：各組小鼠氣管插管后行肺泡灌洗，提取3次肺泡灌洗液共1.2 ml，在4℃下以5000 rpm離心10 min來對BALF進行固化。回收的肺泡灌洗液離心后，吸取上清液檢測細胞因子、SOD活性。去掉BALF的上清液后，細胞沉淀用PBS溶液計數總細胞數與中性粒細胞數。

1.2.4 肺組織MPO活性檢測? BALF上清和肺組織中勻漿在4℃，10 000 rpm離心15 min，取其上清液，分別取各組小鼠的肺組織，在冰上使用勻漿器充分勻漿組織后10 000 r/min離心10 min，收集離心后上清，即為肺組織勻漿液。依照試劑盒說明書的操作步驟測定組織勻漿液在480 nm處的吸光度值，根據吸光度值計算肺組織的MPO活性。操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 細胞因子mRNA表達的測定? 用研磨器將收集右肺中葉組織研碎，取0.1 ml肺組織加入1 ml左右Trizol勻漿。勻漿液置于4℃，12 000 rpm離心，取上清液。按照Trizol法上清液依次加入氯仿、異丙醇，冷75%乙醇（DEPC水配置）混合均勻，棄上清。每管中加入20 ml DEPC處理的水，使總RNA溶解，經核酸紫外分析儀檢測，根據A260/A280b比值，確定樣品中RNA純度及含量。提取各組小鼠右肺的總RNA，并反轉錄cDNA。采用real-time PCR儀擴增檢測Ct值。PCR產物檢測采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為陽性對照，采用2-△△ct法計算肺組織TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA與內參基因的比值。本文中引物序列為：TNF-α的上下游引物分別為：5’-AAATGGGCTCCCTCTA-TCAGTTC-3’，5’-TCTGCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3’，IL-6的上下游引物分別為5-TCCTACCCAACTTCCAATGCTC-3’，5’-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3’，IL-1Β的上下游引物分別為：5’-GCTTCAGGCA-GGCAGTAT-3’，5’-ACAAACCGCTTTTC-CATCT-3’。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪減輕LPS誘導的小鼠肺組織損傷

正常對照組小鼠肺組織、肺泡間隔正常，肺泡腔內無滲出物;LPS組小鼠表現為肺泡間隔明顯增厚、間質水腫、肺泡腔內炎癥細胞浸潤、肺泡結構破壞為特征的肺組織彌漫性病變。與地塞米松（Dex）相似，黃芪各組小鼠肺泡間隔增厚，但較LPS損傷減輕，且高劑量黃芪組較低劑量組損傷輕。見封三圖7。

2.2 黃芪顯著抑制小鼠ALI模型中LPS誘導的炎癥反應

黃芪可減少ALI小鼠肺組織的炎癥細胞浸潤，與正常對照組相比，LPS誘導的ALI小鼠BALF中總細胞數、中性粒細胞數及巨噬細胞數顯著增加，而淋巴細胞計數降低（P<0.05）。見表1、圖1。經重復測量方差分析，不同治療組間總細胞計數（F=69.9537，P<0.001），中性粒細胞計數（F=684.74，P<0.001）;淋巴細胞在不同治療組的水平顯示（F=1324.26，P<0.001），巨噬細胞計數（F=735.965，P<0.001），各組間效應比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與LPS組比較，RA組及DEX組BALF中總細胞數及中性粒細胞數則明顯減少，提示黃芪及DEX明顯抑制了LPS刺激下的炎癥細胞滲出。

2.3 黃芪可減輕ALI小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的表達

與正常對照組相比，LPS誘導后的小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著升高（P<0.01），而黃芪和DEX干預后均可抑制肺組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達（P<0.01）。結果提示，黃芪可通過抑制炎癥介質產生，減少炎癥細胞聚集，從而減輕肺損傷。見圖2。

2.4 黃芪可有效降低ALI小鼠血管通透性

LPS誘導的ALI小鼠肺濕/干重比和總蛋白含量明顯增高。見圖3A。而RA組及DEX組均可顯著抑制LPS引起的BALF總蛋白濃度升高（P<0.01）。見圖3B。因此黃芪可明顯降低LPS誘導小鼠ALI模型中的肺濕/干重比及蛋白滲漏，有效降低血管通透性。

A：LPS組、黃芪治療組各小鼠組間不同肺濕/干重比統(tǒng)計學分析B：各組小鼠BALF總蛋白含量統(tǒng)計學分析。與LPS治療組相比，黃芪治療組肺濕/干重比及BALF總蛋白含量差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。*P<0.05，**P<0.01 vs. LPS，表示差異有統(tǒng)計學意義

2.5 黃芪顯著抑制ALI模型中LPS誘導的氧化應激

本研究通過測量超氧化物歧化酶（SOD）活性來確定黃芪對LPS誘導的ALI小鼠BALF中的氧化應激的影響（圖4）。與NS組、RA組相比，LPS組SOD活性顯著降低（P<0.01）。與NS組相比，RA組SOD活性顯著增加（P<0.01），表明黃芪具有優(yōu)異的抗氧化能力，可能通過抑制氧化應激來減輕肺損傷。

3 討論

ALI是各種肺內、肺外因素導致的急性彌漫性炎癥性肺損傷綜合征，其中肺內炎癥細胞的過度活化，炎癥因子瀑布性釋放和氧化應激是早期急性肺損傷發(fā)病機制中關鍵的因素[5]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的的主要成分之一，可誘導機體免疫應答，激活白細胞，誘導炎癥反應及氧化應激。因此LPS常用于誘導ALI的動物模型[6]。

LPS給小鼠氣管內直接滴入可誘導免疫細胞介導的炎癥反應網絡，引起一系列的前炎因子釋放，最終導致肺部急性炎癥反應[7-8]。本研究通過應用LPS氣管內直接滴入法誘導小鼠急性肺損傷模型，結果顯示LPS（0.5 mg/kg，100 μl）氣管滴入24 h后BALF中的白細胞和中性粒細胞數目顯著增加，肺水腫明顯，肺濕/干重指數增高，肺組織以明顯的炎癥細胞浸潤、肺毛細血管通透性增加、肺水腫為主要表現;BALF中SOD下降，肺組織中MPO增高，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA顯著表達。這些均提示，LPS首先激活中性粒細胞和肺泡巨噬細胞、內皮細胞和血小板，進一步誘導氧自由基募集，失控性地釋放炎癥因子及溶酶體的產生和釋放，參與ALI的發(fā)生和發(fā)展[9]。其中，早期反應細胞因子IL-1β與TNF-α進一步促進如IL-2、IL-6、巨噬細胞炎癥蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）、MIP-1β等從而誘導單核/巨噬細胞遷移趨化，放大炎癥過程，引起級聯“瀑布效應”[10-11]，最終導致血管通透性增高、肺水腫及透明膜形成[12]。

中草藥治療ALI療效確切，并被臨床及實驗研究所證實[13-14]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為ALI的發(fā)生與六淫邪氣、房勞傷腎、情志內傷及先天稟賦不足有關[15-16]。其病位在肺，瘀、痰、熱為標，涉及脾腎，屬本虛標實之證;而黃芪作為補氣健脾固表之圣藥，先前研究中已明確證實其可有效預防肺損傷[18-20]。本研究結果同樣表明黃芪對LPS誘導的小鼠急性肺損傷有很強的保護作用。黃芪能夠顯著減輕LPS誘導的肺部炎癥，包括對炎癥細胞滲出（巨噬細胞、中性粒細胞）和促炎介質（TNF-α、IL-6、IL-1β）產生有效抑制。同時黃芪及DEX對ALI小鼠BALF的蛋白滲出均有顯著的抑制作用。因此，黃芪與地塞米松治療ALI肺組織損傷及蛋白質滲出療效可能是相近的[18-12]。同時肺組織形態(tài)學提示黃芪可以減輕LPS誘導所致的肺組織炎癥水腫、出血、肺泡結構及血管損傷性改變。提示黃芪對LPS誘導的肺損傷保護作用可能與其阻止炎癥細胞向肺泡腔內遷移能力有關。

綜上所述，本研究通過建立黃芪治療小鼠LPS誘導的小鼠肺損傷模型，評估黃芪對小鼠肺損傷的保護作用。發(fā)現黃芪能顯著預防炎癥細胞遷移，降低細胞計數、減輕肺水腫，降低BALF中總蛋白質含量，提高SOD活性，降低肺組織炎癥細胞因子的表達，并顯著保護LPS誘導小鼠的肺損傷。組織學研究表明，黃芪可顯著抑制ALI小鼠肺組織中性粒細胞的浸潤。結果表明，黃芪對LPS誘導的小鼠ALI具有保護作用。此外，對詳細評價黃芪藥理學機制至關重要，為ALI的防治研究提供新的實驗基礎。

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（收稿日期：2021-01-05）