許文麗 邢秀月 徐川微

(1?？谑腥嗣襻t(yī)院婦產(chǎn)科，海南 ?？?570208；2瓊海市人民醫(yī)院婦科)

宮頸癌是臨床常見的婦科疾病，其病死率較高且已嚴(yán)重威脅女性生命健康，目前宮頸癌的診斷及治療取得一定進(jìn)展，但患者預(yù)后不佳〔1〕。微小RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈RNA，宮頸癌中miRNA表達(dá)失調(diào)可能作為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)〔2～4〕。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-188-5p(miR-188-5p)在胃癌、急性髓細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)，并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用〔5,6〕。但miR-188-5p對宮頸癌的影響尚未可知。TargetScan預(yù)測顯示NIMA相關(guān)激酶(Nek)6可能是miR-188-5p的靶基因，研究表明Nek6在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可能是惡性腫瘤的潛在治療靶位點(diǎn)〔7〕。本研究旨在探討miR-188-5p在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 宮頸癌HeLa細(xì)胞購自上海信裕生物。Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；si-Nek6、si-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-188-5p mimics、anti-miR-188-5p、miR-NC、anti-miR-NC購自廣州銳博生物；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；pcDNA3.1購自上海遠(yuǎn)慕生物；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma；甲基噻唑基四唑(MTT)購自上海澤葉生物；Transwell小室購自美國Corning；兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國CST；二抗購自武漢艾美捷；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、E-cadherin、P21抗體購自美國Santa Cruz；基質(zhì)膠購自美國BD。收集2016年8月至2018年6月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的33例宮頸癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，年齡50～70歲，平均(65.85±5.57)歲。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 HeLa細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞70%時融合用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，實(shí)驗(yàn)分組：miR-NC組(將miR-NC轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞)、si-NC組(將si-NC轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞)、miR-188-5p組(將miR-188-5p mimics轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞)、si-Nek6組(將si-Nek6轉(zhuǎn)至HeLa細(xì)胞)、miR-188-5p+pcDNA3.1組(將miR-188-5p mimics與pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞)、miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6組(將miR-188-5p mimics與pcDNA3.1-Nek6共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞)。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-188-5p的表達(dá)水平 Trizol法提取組織樣本、各組宮頸癌細(xì)胞總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行qRT-PCR。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-188-5p相對表達(dá)量(內(nèi)參為U6)。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 0.25%胰蛋白酶消化各組HeLa細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取150 μl接種于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，避光振蕩溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀分析各孔吸光度值。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將各組HeLa細(xì)胞接種于12孔板，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞數(shù)高于50個即為一個集落，直至12孔板集落之間發(fā)生相互融合結(jié)束計(jì)數(shù)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用500 μl的1×結(jié)合緩沖液重懸HeLa細(xì)胞，依照凋亡試劑盒說明書分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：將宮頸癌HeLa細(xì)胞按照每孔200 μl的密度將細(xì)胞懸液加入小室的上室，含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室600 μl，培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定遷移細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：先用預(yù)冷的培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠，然后取Transwell小室包被基質(zhì)膠，后續(xù)步驟同遷移測定。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 構(gòu)建野生型載體WT-Nek6與突變型載體MUT-Nek6，將WT-Nek6與miR-NC、MUT-Nek6與miR-NC、WT-Nek6與miR-188-5p mimics、MUT-Nek6與miR-188-5p mimics共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，測定相對熒光素酶活性。

1.2.8Western印跡檢測Nek6、Bcl-2、MMP-2、P21、E-cadherin、Bax、CyclinD1蛋白表達(dá) RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，120 V SDS-PAGE分離90 min，200 mA轉(zhuǎn)膜30 min。膜封閉后，用特異性一抗4℃孵育過夜，用二抗室溫孵育1 h，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶相對于GAPDH灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-188-5p在宮頸癌組織中表達(dá)情況 宮頸癌組織中miR-188-5p的表達(dá)水平(0.34±0.03)低于癌旁組織(1.02±0.10，P<0.05)。

2.2過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡的影響 miR-188-5p過表達(dá)可降低細(xì)胞存活率及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)量，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡率及P21、Bax蛋白表達(dá)，而細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，見圖1、表1。

A：過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響；B：過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞凋亡的影響；C：過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲的影響 miR-188-5p過表達(dá)可促使遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，并可抑制MMP-2表達(dá)而促進(jìn)E-cadherin表達(dá)(P<0.05)，見表1、圖2。

A：過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)；B：過表達(dá)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-188-5p靶向、調(diào)控Nek6 Nek6的3′UTR含有miR-188-5p的互補(bǔ)序列，見圖3。miR-188-5p和WT-Nek6共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性低于miR-NC和WT-Nek6共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見表2。miR-188-5p可負(fù)向調(diào)控Nek6的表達(dá)(P<0.05)，見圖4。與miR-NC組比較(0.95±0.10)，miR-188-5p組Nek6蛋白水平明顯降低(0.34±0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組比較(0.97±0.10)，anti-miR-188-5p組Nek6蛋白水平升高(1.46±0.15，P<0.05)。

圖3 Nek6的3′UTR含有miR-188-5p的互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4:miR-NC組，miR-188-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-188-5p組圖4 miR-188-5p調(diào)控Nek6的表達(dá)

2.5抑制Nek6對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 抑制Nek6表達(dá)可降低細(xì)胞存活率及CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表達(dá)量，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡及P21、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)，克隆形成細(xì)胞數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，見圖5、表3。

A：抑制Nek6對HeLa細(xì)胞凋亡的影響；B：抑制Nek6對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)；C：抑制Nek6對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.6過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡的作用 miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6組HeLa細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞形成數(shù)高于miR-188-5p+pcDNA3.1組(P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平高于miR-188-5p+pcDNA3.1組(P<0.05)，凋亡率、P21和Bax蛋白水平低于miR-188-5p+pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖6、圖7、表4、圖8。

圖6 過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞克隆形成的影響

圖7 過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

1～4：miR-NC組、miR-188-5p組、miR-188-5p+pcDNA3.1組、miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6組，圖9同圖8 Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

2.7過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲的作用 與miR-188-5p+pcDNA3.1組比較，miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6組HeLa細(xì)胞Nek6、MMP-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白、miR-188-5p水平明顯降低(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖9、表5、圖10。

圖9 過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖10 過表達(dá)Nek6能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p對HeLa細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃癌、肝癌miR-188-5p表達(dá)下調(diào)有助于腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移〔8～10〕。miR-188-5p在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可通過靶向Rap2c的表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖〔11〕。但miR-188-5p在宮頸癌中的表達(dá)狀態(tài)尚未可知。本研究結(jié)果提示miR-188-5p可能通過抑制宮頸癌細(xì)胞增殖從而參與宮頸癌的發(fā)生過程。CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，P21的作用與之相反〔12〕。本研究提示miR-188-5p可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。Bcl-2可發(fā)揮抗凋亡作用，Bax可發(fā)揮促凋亡作用〔13〕。本研究結(jié)果提示miR-188-5p可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。E-cadherin上調(diào)可阻礙EMT進(jìn)程，抑制腫瘤遷移及侵襲；MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)并誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移〔14〕。本研究結(jié)果提示miR-188-5p過表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲。

Nek6在結(jié)直腸腺癌、卵巢癌等腫瘤中的表達(dá)水平升高，并可發(fā)揮促癌基因作用〔15～17〕。本研究證實(shí)miR-188-5p可靶向結(jié)合Nek6，抑制Nek6的表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Nek6過表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-188-5p過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。

綜上，miR-188-5p通過靶向負(fù)調(diào)控Nek6來誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移及侵襲，為揭示miR-188-5p在宮頸癌的抑癌功能及作用機(jī)制提供新方向，為闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，可為宮頸癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。