馮玉杰 朱 蕓 李永梅 韓紅艷 祝建波

（1晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中 030619；2石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832000；3石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000）

蛹蟲草Cordyceps militaris，又名北冬蟲夏草，主要寄生在鱗翅目昆蟲的幼蟲及蛹[1-2]。蛹蟲草與冬蟲夏草同屬異種，其藥用成分相似，是冬蟲夏草理想的替代品[3-4]，且蛹蟲草還含有具有抗癌作用的蟲草素（3’-deoxyadenosine）和噴司他丁（2’-deoxycoformycin）[5]，因此，蛹蟲草具有較高的利用價值。蛹蟲草人工栽培技術(shù)的發(fā)展解決了野生資源短缺的難題。目前人工培養(yǎng)的子實體主要以大米、小麥為主料的固體基質(zhì)[6-7]。

子實體產(chǎn)量和品質(zhì)是關(guān)系蛹蟲草人工栽培的重要經(jīng)濟指標。遺傳基礎(chǔ)和環(huán)境條件是影響子實體產(chǎn)量及有效成分含量的兩個因素[8]。研究表明，蛹蟲草子實體產(chǎn)量和有效成分含量與栽培基質(zhì)、光照和溫度等環(huán)境條件有關(guān)[9-11]。人工栽培食用菌過程中，溫差刺激是變溫結(jié)實性食用菌形成子實體的必要條件，適當?shù)臏夭畲碳つ軌虼龠M原基形成，提高子實體均一性[12-13]、縮短生長周期[14]。菌絲生長、原基形成階段和子實體生長階段采用變溫培養(yǎng)有利于提高蛹蟲草子實體產(chǎn)量和有效成分含量[15]。野生蟲草生長的環(huán)境存在晝夜溫差，溫差刺激對蛹蟲草子實體產(chǎn)量及有效成分含量的影響研究較少。研究以雜交選育蛹蟲草菌株為材料，設(shè)置不同溫差刺激時間、不同溫差，考察其對蛹蟲草子實體產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為蛹蟲草人工栽培提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）蛹蟲草菌株：CMS1 與CMZ1 菌種，保存于石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室；

（2）主要試劑和儀器：甲醇、乙醇均為色譜純（天津市富宇精細化工有限公司）；腺苷對照品（純度≥99%，上海源葉生物科技公司）；蟲草素對照品（純度≥99.6%，合肥博美生物科技有限公司）；其他試劑為化學(xué)純。

Waters2695 高效液相色譜儀、Waters2998 二極管陣列檢測器（美國Waters）、SunFireC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱（美國Waters）；SPE 固相萃取柱（BAKERBOND公司）；培養(yǎng)箱（Zxjd-A1270）。

（3）培養(yǎng)基：菌種保存和活化培養(yǎng)基（1 L）為200 g 馬鈴薯浸提液，葡萄糖20 g；PDA 液體加富培養(yǎng)基（1 L）為200 g 馬鈴薯浸提液，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.5 g 和維生素B10.01 g，pH6.0；液體營養(yǎng)液（1 L）為PDA 液體加富培養(yǎng)基，蠶蛹粉12 g；栽培基質(zhì)為每盒小麥30 g，液體營養(yǎng)液45 mL。

（4）培養(yǎng)盒：TC-S750（5 cm×7 cm×12 cm 帶透氣膜）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將4 ℃試管斜面保存的菌株CMS1 與CMZ1 分別轉(zhuǎn)接到PDA固體加富培養(yǎng)基中，于25 ℃避光培養(yǎng)活化，待菌絲接近培養(yǎng)皿邊緣，用無菌接種針挑取菌落邊緣0.5 cm×0.5 cm 菌塊轉(zhuǎn)接到50 mL PDA 液體加富培養(yǎng)基中，于25 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d，備用。

1.2.2 固體栽培基質(zhì)制備及接種

將栽培基質(zhì)于115 ℃高壓滅菌20 min，并冷卻至室溫后，在超凈工作臺上用移液器吸取5 mL菌種發(fā)酵液，均勻接種到基質(zhì)表面。將培養(yǎng)盒置于20～22 ℃避光培養(yǎng)，直到菌絲“吃透”培養(yǎng)基。

1.2.3 溫差刺激及子實體培養(yǎng)

將培養(yǎng)盒移至1000 lx 熒光燈下，給予14 h 光照后，挑選菌絲長勢一致的培養(yǎng)盒，隨機分成兩批。第一批：置于溫度為10 ℃的低溫培養(yǎng)箱，分別為每天2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 處理，以20 ℃（室溫）為對照，共低溫處理7 d；第二批：將培養(yǎng)盒分別置于5 ℃、10 ℃、15 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，以20 ℃為對照，共處理7 d。低溫處理后，將培養(yǎng)盒置于20 ℃的培養(yǎng)室避光培養(yǎng)。待低溫處理完后，進行光照，光照時間14 h/d（所有處理組光照時間相同），每個處理3個重復(fù)。

溫差刺激處理結(jié)束后，將培養(yǎng)盒置于22 ℃恒溫，光照強度1000 lx，光照時間為10 h/d，保持培養(yǎng)室內(nèi)空氣相對濕度70%，培養(yǎng)45 d后采收子實體。

1.2.4 樣品收集和處理

將采收的蛹蟲草子實體分別計數(shù)并于60 ℃烘干至恒重，記錄子實體產(chǎn)量。

1.2.5 子實體中蟲草素和腺苷含量的測定

采用已建立的HPLC 法[16]，測定蛹蟲草子實體中蟲草素和腺苷含量，具體方法：蛹蟲草子實體粉碎后，采用超聲輔助提取法提取蟲草素和腺苷，流動相為（A）甲醇∶（B）水=11∶89，流速為1 mL/min，檢測波長為260 nm。蟲草素標準曲線回歸方程為：Y=2919.5X+718.5（r2=0.9945），腺苷標準曲線方程為：Y=2524.9X-5610.9（r2=0.9988）（Y為色譜峰面積，X為進樣量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫差刺激對蛹蟲草子實體數(shù)量和產(chǎn)量的影響

由圖1 可知，低溫10 ℃處理6 h/d，供試蛹蟲草菌株CMS1，子實體平均朵數(shù)為59.67±1.67，與8 h/d無顯著性差異；子實體平均每盒產(chǎn)量為（2.48±0.07）g，與2 h/d、4 h/d 無顯著性差異，低溫處理8 h/d 與10 h/d，子實體數(shù)量和干重無顯著性差異，且與未經(jīng)溫差刺激（0 h）的子實體干重無顯著性差異；CMZ1菌株不經(jīng)低溫刺激（0 h），子實體平均朵數(shù)為68.00±2.08，顯著高于低溫刺激；低溫處理2 h/d 時子實體產(chǎn)量最高，為4.00 g±0.21 g，且顯著高于其他處理組。試驗菌株的子實體數(shù)和產(chǎn)量在相同的溫差條件，呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。

圖1 低溫持續(xù)時間對蛹蟲草子實體數(shù)量和干重的影響

由圖2可知，不同的低溫條件下處理供試菌株，隨著處理溫度下降，CMS1 菌株子實體數(shù)量逐漸增多，5 ℃低溫處理組，CMS1 子實體數(shù)量和產(chǎn)量顯著高于其他處理組，10 ℃、15 ℃低溫處理組，子實體產(chǎn)量無顯著性差異；CMZ1 菌株5 ℃處理組、20 ℃處理組，子實體數(shù)量顯著高于10 ℃處理組、15 ℃處理組，而5 ℃處理組、10 ℃處理組與15 ℃處理組子實體產(chǎn)量無顯著性差異。供試蛹蟲草菌株經(jīng)低溫處理后，子實體產(chǎn)量顯著高于未經(jīng)低溫刺激（20 ℃）組，表明低溫刺激可以提高子實體產(chǎn)量。

圖2 低溫強度對蛹蟲草子實體數(shù)量和干重的影響

2.2 溫差刺激對蛹蟲草子實體中蟲草素和腺苷質(zhì)量分數(shù)的影響

由表1 可知，10 ℃低溫處理不同時間對供試蛹蟲草菌株子實體中蟲草素和腺苷質(zhì)量分數(shù)有影響，在低溫處理4 h/d，CMS1和CMZ1中蟲草素質(zhì)量分數(shù)最高，隨著低溫處理持續(xù)時間延長，蟲草素質(zhì)量分數(shù)逐漸下降；而CMZ1 菌株處理8 h/d 組子實體中蟲草素質(zhì)量分數(shù)高于處理6 h/d組；相對于蟲草素質(zhì)量分數(shù)的變化，腺苷質(zhì)量分數(shù)受低溫刺激時長的影響則相對較小。

表1 10 ℃低溫處理持續(xù)時間對蟲草素和腺苷質(zhì)量分數(shù)的影響

由表2可知，低溫10 ℃和15 ℃處理4 h/d，CMZ1、CMS1 菌株收獲的子實體中蟲草素質(zhì)量分數(shù)較高；15 ℃處理，CMS1 菌株子實體腺苷質(zhì)量分數(shù)最高，但CMZ1菌株子實體腺苷質(zhì)量分數(shù)變化不大。5 ℃處理，CMS1 子實體蟲草素質(zhì)量分數(shù)較其他處理組低，而CMZ1菌株子實體腺苷質(zhì)量分數(shù)變幅較小。

表2 不同低溫刺激對蟲草素和腺苷質(zhì)量分數(shù)的影響

3 小結(jié)與討論

建立標準化的栽培環(huán)境是提高蛹蟲草商品性的重要保證，其前提是菌種穩(wěn)定性較好，在此基礎(chǔ)上，通過控制環(huán)境條件，從而保證產(chǎn)品一致性。試驗所用材料為同一子實體分離的兩株菌株，而對溫差刺激的反應(yīng)存在一定的差異，可能是由于組織分離獲得的菌株中包含母種菌絲和部分子囊孢子菌株，混合型菌株在繼代和培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出群體表型。

人工栽培蛹蟲草子實體產(chǎn)量和品質(zhì)還受培養(yǎng)條件影響，研究表明光照和溫度是影響其有效成分的重要因素[17-19]。蛹蟲草生長過程包括菌絲生長、轉(zhuǎn)色（原基形成）和子實體生長三個階段，其中原基是蛹蟲草子實體形成的關(guān)鍵，對于變溫結(jié)實食用菌，溫差刺激是原基形成的必要條件，在人工培養(yǎng)蛹蟲草過程中，通常采用8～10 ℃的溫差，且每天持續(xù)時間不少于10 h[20-21]。溫差刺激的條件大都根據(jù)大多數(shù)變溫結(jié)實性食用菌而定，而溫差刺激對子實體產(chǎn)量和有效成分含量的影響值得深入研究。試驗結(jié)果表明，蛹蟲草在恒溫（即不經(jīng)溫差刺激）條件下能形成子實體，當溫差刺激時間超過8 h/d，子實體的產(chǎn)量和蟲草素質(zhì)量分數(shù)較低，（4～6）h/d 的低溫刺激更有利于提高蛹蟲草子實體產(chǎn)量和蟲草素質(zhì)量分數(shù)。盡管5 ℃低溫處理組，蛹蟲草子實體產(chǎn)量較高，但其蟲草素質(zhì)量分數(shù)較低，可能是由于溫差強度升高，原基數(shù)量增多，蛹蟲草后期生長所需的營養(yǎng)成分供給不足，影響其生長，反而不利于有效成分的積累。因此，建議在原基形成階段，采取低溫為10～15 ℃，4 h/d 的溫差刺激，以提高子實體產(chǎn)量和有效成分含量。

蛹蟲草人工栽培一般在溫室大棚或廠房，溫差刺激需要借助降溫設(shè)施，增加了資金投入和運行成本。試驗僅在原基形成階段對蛹蟲草進行溫差刺激，子實體生長發(fā)育后期則采用恒溫條件培養(yǎng)，在蛹蟲草整個生長過程進行溫差刺激對其產(chǎn)量及有效成分含量的影響還有待于進一步研究。