葉 靖，楊元玲，史慶秋，吳龍飛，宋國(guó)濤

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 林學(xué)系，新疆 石河子 832003)

microRNA(miRNA)是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的長(zhǎng)度為18～25 nt的內(nèi)源非編碼RNA。它是真核生物基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，通過(guò)介導(dǎo)靶基因mRNA的切割或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明，植物的成花誘導(dǎo)、花器官形成、種子形成、果實(shí)發(fā)育、生物或非生物脅迫響應(yīng)等重要生命進(jìn)程都受到miRNA的調(diào)控，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

miR172是廣泛分布于植物中且高度保守的miRNA之一。miR172 家族主要通過(guò)調(diào)控 AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)。其在擬南芥()的花器官形成和開花時(shí)間、大花牽牛()的成花誘導(dǎo)、水稻(L.)的生殖生長(zhǎng)、植物葉片由幼葉向成熟葉轉(zhuǎn)變、大豆[(Linn.) Merr.]根瘤形成、馬鈴薯(L.)塊莖形成等過(guò)程中起到重要作用。此外，miR172在植物響應(yīng)干旱、低溫、鹽等非生物脅迫過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。

杜仲(Oliver)又名思仲、絲棉樹等，是我國(guó)特有的重要經(jīng)濟(jì)樹種。因杜仲具有較高的藥用價(jià)值并且能夠生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的天然橡膠而備受人們關(guān)注，是我國(guó)非常重要的國(guó)家戰(zhàn)略資源。miRNA作為植物基因表達(dá)調(diào)控的重要研究部分，對(duì)探究杜仲的各類生命過(guò)程具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行杜仲miR172基因家族前體及成熟體的序列特征分析、系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律研究、啟動(dòng)子預(yù)測(cè)、靶基因預(yù)測(cè)及功能分析等，從而系統(tǒng)地了解杜仲miR172基因家族的進(jìn)化特征及功能，為其在杜仲分子育種中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

通過(guò)杜仲葉片小 RNA 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：SRP216820)及文獻(xiàn)[27]中獲取杜仲 miR172家族成員的前體序列和成熟體序列。從miRbase(Release 22.1)數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.mirbase.org/)中下載擬南芥、煙草()、毛果楊()、蘋果()、柑橘()、葡萄()、碧桃()7個(gè)物種的miR172家族成員的前體序列和成熟體序列。

1.2 方法

1.2.1 eu-miR172家族的進(jìn)化分析

使用 DNAMAN (ver. 6.0) 軟件對(duì)杜仲miR172家族成員的成熟體序列進(jìn)行多重比對(duì)，并利用在線軟件 WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析杜仲miR172家族成員間的堿基保守性，并繪制Logo圖。利用MEGA 6.0軟件采用鄰近法(Neighbor-joining， NJ)構(gòu)建上述 8 種植物的miR172家族成員成熟體序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，用1 000次重復(fù)的自展法(Bootstrap)檢驗(yàn)進(jìn)化樹。

1.2.2 eu-miR172 家族前體序列的堿基保守性分析

使用在線軟件RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測(cè)杜仲各 pre-miR172的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析參數(shù)為軟件默認(rèn)值。pre-miR172 前體序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建方法同 1.2.1節(jié)。

1.2.3 eu-miR172 家族的啟動(dòng)子分析

截取杜仲miR172家族前體上游的2 000 bp序列作為啟動(dòng)子分析區(qū)域，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)主要的順式作用元件。

1.2.4 eu-miR172 家族的靶基因預(yù)測(cè)

使用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis？function=3)以杜仲轉(zhuǎn)錄組的unigene作為候選序列進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，將期望值(Expectation)設(shè)置為3，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲 miR172 家族成熟體序列分析

目前，miRBase(Release 22.1)中共收錄了223個(gè)miR172家族成熟體成員，廣泛分布于43個(gè)物種中。miR172家族在不同物種中的成員數(shù)量差異較大，蘋果中的數(shù)量最多，有16個(gè)；大豆次之，有15個(gè)；而二倍體棉花、豆角、快樂(lè)鼠尾草、蓖麻等植物中僅有1個(gè)成員。本試驗(yàn)結(jié)合 sRNA 測(cè)序結(jié)果和已發(fā)表文獻(xiàn)，在杜仲中鑒定出8個(gè) miR172 家族成熟體，序列長(zhǎng)度在19～22 nt。用WebLogo和DNAMAN軟件分析成員間的堿基保守性，發(fā)現(xiàn)杜仲 miR172家族成員間僅有7個(gè)位點(diǎn)完全保守(圖1-A)；但除了eu-miR172d-5p以外，其他7 個(gè)成員在第2～19個(gè)位點(diǎn)的堿基完全一致，只在序列兩端存在變異，且eu-miR172b-3p與 eu-miR172c的成熟體序列完全一致(圖1-B)。說(shuō)明杜仲miR172家族在進(jìn)化過(guò)程中功能相對(duì)保守，但也存在功能分化。

為了進(jìn)一步分析杜仲miR172家族的進(jìn)化特征，本試驗(yàn)基于模式植物擬南芥、煙草和毛果楊以及其他4種木本植物的miR172家族的70個(gè)成熟體序列構(gòu)建進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)這70個(gè)miR172成員被明顯地分為兩支，其中柑橘、擬南芥、杜仲、碧桃、毛果楊的12個(gè)miR172成員被聚為一支，而另一支包括蘋果、葡萄、煙草的所有miR172成員以及其他5個(gè)物種的大多數(shù)miR172成員，說(shuō)明植物的miR172家族在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，但有少部分的成員在進(jìn)化過(guò)程中存在功能分化。除eu-miR172d-5p以外，杜仲的其他7個(gè)miR172家族成員被聚在一個(gè)主要的大支中，并且它們被聚在一起(圖2)，進(jìn)一步說(shuō)明杜仲miR172家族在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，而個(gè)別成員出現(xiàn)了功能分化。

2.2 杜仲miR172家族前體序列分析

通過(guò)小RNA測(cè)序和文獻(xiàn)搜索，共獲得8條杜仲miR172家族前體序列。eu-miR172前體序列長(zhǎng)度分布在133～250 nt；序列變異較大，保守性僅有25.17%，但在產(chǎn)生成熟體序列的位置高度保守，僅個(gè)別堿基存在變異(圖3)。使用在線軟件 RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/) 分析杜仲miR172家族前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，杜仲miR172家族的8條前體均能形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最小折疊自由能(dG)在-69.50～-48.40 kcal·mol；除了eu-miR172-5p產(chǎn)生于二級(jí)結(jié)構(gòu)的5′臂上以外，其余7個(gè)成員的成熟體均位于3′臂上(圖4)。

從miRbase(Release 22.1)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥、煙草、毛果楊、蘋果、柑橘、碧桃、葡萄的所有MIR172成員(共53條)，與本實(shí)驗(yàn)的8條杜仲M(fèi)IR172家族一起構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，以上8個(gè)物種的miR172家族前體保守性均較低，61個(gè)MIR172成員在進(jìn)化樹中的分布較為分散，沒有聚集的現(xiàn)象(圖5)，說(shuō)明植物miR172家族前體的進(jìn)化模式與成熟體不同。

A，堿基序列保守性；B，序列比對(duì)。A， Base sequence conservation; B， Multiple sequence alignment.圖1 杜仲 miR172 家族成員成熟體序列保守性分析Fig.1 Conservation analysis of mature sequences of miR172 family members from E. ulmoides

eu，杜仲；ath，擬南芥；nta，煙草；ptc，毛果楊；mdm，蘋果；csi，柑橘；vvi，葡萄；ppe，碧桃。下同。eu， Eucommia ulmoides; ath， Arabidopsis thaliana; nta， Nicotiana tabacum; ptc， Citrus trifoliata; mdm， Malus domestica; csi， Citrus reticulata; vvi， Vitis vinifera; ppe， Prunus persica. The same as below.圖2 植物miR172家族進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of miR172 family in plant

圖3 杜仲 miR172 家族前體序列比對(duì)分析Fig.3 Precursor sequence alignment analysis of eu-miR172 family from E. ulmoides

圖4 eu-miR172 前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structures of eu-miR172 precursors

圖5 植物 MIR172 家族進(jìn)化分析Fig.5 Evolutionary analysis of plant MIR172 family

2.3 杜仲miR172家族啟動(dòng)子分析

截取杜仲pre-miR172上游的2 000 bp序列作為啟動(dòng)子分析區(qū)域，利用在線軟件 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)預(yù)測(cè)順式作用元件。8 個(gè)杜仲miR172家族成員啟動(dòng)子區(qū)域均含有核心順式作用元件TATA-box和CAAT-box；此外，還包含許多其他順式作用元件，包括光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、生物脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)元件、厭氧脅迫元件、晝夜節(jié)律響應(yīng)元件、類黃酮生物合成相關(guān)元件、胚乳表達(dá)元件等。其中，所有miR172家族成員均含有光響應(yīng)元件，并且種類豐富，包括GT1-motif、MRE、Box 4、TCT-motif、LAMP-element、AT1-motif、AE-box、sp1、GA-motif、chs-CMA1a、chs-CMA2a、GATA-motif、I-box、TCCC-motif。此外，部分miR172家族成員含有干旱脅迫響應(yīng)元件(MBS)、生物脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、激素響應(yīng)元件(TCA-element、SARE、AuxRR-core)、分生組織表達(dá)元件(CAT-box)、厭氧脅迫元件(ARE)、晝夜節(jié)律響應(yīng)元件(circadian)、類黃酮生物合成相關(guān)元件(MBSI)、胚乳表達(dá)元件(GCN4-motif)(表1)，推測(cè)杜仲miR172家族參與多種調(diào)控途徑。

2.4 杜仲miR172家族的靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

表1 杜仲miR172家族啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件

為了解杜仲miR172家族各成員的生物學(xué)功能，本研究利用psRNAtarget軟件為 eu-miR172 家族成員共預(yù)測(cè)到33個(gè)靶基因，各成員的靶基因數(shù)量為6(eu-miR172d-5p)～17(eu-miR172j)個(gè)。其中，eu-miR172a、eu-miR172a-3p、eu-miR172b-3p和eu-miR172c的靶基因完全相同(表2)，表明eu-miR172家族成員的功能具有很高的保守性。此外，對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋，有14個(gè)靶基因注釋到相應(yīng)的功能，這些靶基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫、響應(yīng)激素調(diào)節(jié)、油脂合成或降解以及甲基化等生物學(xué)過(guò)程(表2)，說(shuō)明eu-miR172家族在杜仲的生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且eu-miR172的功能存在廣泛性。

表2 杜仲miR172家族成員的靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋

3 討論

研究miRNA基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化及預(yù)測(cè)其調(diào)控功能對(duì)有效利用miRNA進(jìn)行分子育種具有重要作用。miR172家族是廣泛分布于被子植物中極度保守的miRNA家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆脅迫等方面具有重要調(diào)控作用。有關(guān)miR172在擬南芥、小麥(L.)、水稻、大豆、楊樹()等植物中的研究較為深入，但在杜仲中的研究尚處空白。本研究從杜仲葉片小RNA文庫(kù)以及文獻(xiàn)中獲得杜仲miR172基因家族的 8 條成熟體序列和 8 條前體序列用于杜仲miR172基因家族分析；此外，在miRbase(Release 22.1)中下載擬南芥、煙草、毛果楊等其他7個(gè)物種的所有miR172家族成熟體和前體序列，用于miR172家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析。研究表明，除eu-miR172d-5p以外，杜仲的miR172家族各成員的成熟體序列相似度很高，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中各物種的miR172成熟體多數(shù)被聚為一支，說(shuō)明miR172在進(jìn)化上和功能上具有潛在的保守性。但eu-miR172d-5p的成熟體序列與其他7個(gè)成員的差異較大，可能是由于他們?cè)谇绑w莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的位置不同行造成的，這與劉煒?gòu)O等的研究一致；并且miR172家族前體序列的保守性較差，在進(jìn)化樹中的聚類較為分散，表明miR172家族在進(jìn)化過(guò)程中還存在特異性，功能也存在分化。

基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及順式作用元件組成可影響其表達(dá)特征。杜仲miR172基因家族的啟動(dòng)子區(qū)域包含光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、生物脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件等多種順式作用元件，且不同家族成員的順式作用元件各不相同，說(shuō)明miR172基因家族成員在杜仲的不同生命進(jìn)程中發(fā)揮不同作用或者不同成員間起到協(xié)同調(diào)控的作用。

miR172基因家族是植物中發(fā)現(xiàn)較早、研究較多的小RNA家族。研究者們通過(guò)基因克隆、高通量測(cè)量、基因過(guò)表達(dá)或基因敲除等手段證實(shí)miR172家族能夠調(diào)控植物葉片發(fā)育、根發(fā)育、植物塊莖和假鱗莖的形成、花器官的形成和發(fā)育、果實(shí)和種子的發(fā)育、植物幼嫩器官向成熟器官的過(guò)渡等生命過(guò)程。不同物種中miR172家族的靶基因數(shù)目和種類差別很大，但幾乎所有物種的miR172均能調(diào)控AP2或AP2-like基因家族成員，且該基因家族是 miR172調(diào)控的主要對(duì)象。說(shuō)明miR172家族的功能具有多樣性，同時(shí)在不同物種間還存在保守性。本研究為杜仲miR172基因家族預(yù)測(cè)到33個(gè)靶基因，這些靶基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫、響應(yīng)激素調(diào)節(jié)、油脂合成或降解以及甲基化等生物學(xué)過(guò)程，并且其主要的靶基因?yàn)?基因，說(shuō)明杜仲miR172基因家族功能同樣具有保守性和廣泛性，其分子調(diào)控功能與該小RNA家族在其他物種中的功能相似。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究miR172家族在杜仲生命過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制提供一定參考。

4 結(jié)論

杜仲miR172家族成員在進(jìn)化過(guò)程中既保守又有一定分化，其主要通過(guò)調(diào)控2基因的表達(dá)在杜仲生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。