王水濤，何盛盛，江玲麗，高有領，*

(1.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100； 2.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315100)

中華鱉()營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸、維生素和微量元素，具有良好的養(yǎng)殖效益，是我國重要的特種經(jīng)濟水生動物。近年來，隨著消費市場的成熟，中華鱉養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速，2019年我國所有種類鱉的產(chǎn)量達到32.55萬t，其中，中華鱉占了絕大部分，但頻發(fā)的病害，嚴重制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。危害中華鱉的病原種類繁多，其中，病毒性疾病由于缺乏有效的診斷方法和防治方法，危害性遠高于其他病原引起的疾病。先前，對中華鱉病毒性疾病的研究主要集中在組織病理學、超微結構變化和電鏡觀察等方面，這些方法雖然能分離和鑒定出一些病毒病，但關于大部分病毒病的發(fā)生和致病機理尚不明確。病毒只能在天然宿主或其他合適的活細胞內(nèi)繁殖，且病毒感染宿主時有種屬特異性；因此，建立中華鱉源細胞系對其免疫學和病原微生物學研究來說都非常重要。目前，研究人員已在中華鱉的細胞系建立和培養(yǎng)條件優(yōu)化方面取得了一些進展：李曉莉等建立了中華鱉腎、脾細胞系；郭海杰建立了中華鱉心細胞系，并對細胞培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。與畜禽類和魚類相比，國內(nèi)外關于鱉類細胞研究的廣度和深度還遠遠不夠。而且，上述關于鱉的細胞原代培養(yǎng)方法均需從成體中采集組織塊，并基于組織塊遷移法開展。該類方法雖已被證實可行，但也存在著一些缺點，例如：由于成體難以徹底消毒，細胞污染的概率較大；且培養(yǎng)液中存在大塊的組織塊，易造成培養(yǎng)的細胞類型不單一。本實驗擬使用無菌的鱉胚胎，采用胰蛋白酶消化結合細胞過濾器的方法，解決上述問題。

維甲酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)可以識別病毒RNA，激活干擾素生成通路并生成干擾素，從而發(fā)揮抗病毒的作用。在RIG-Ⅰ識別并區(qū)別對待外源病毒RNA和自身RNA的過程中，-甲基腺苷(mA)修飾發(fā)揮重要的作用。機體自身的RNA經(jīng)過mA修飾以后，不會激活干擾素系統(tǒng)，而外源的病毒RNA未經(jīng)mA修飾，可激活該系統(tǒng)，進而產(chǎn)生干擾素。在mA修飾環(huán)狀RNA的過程中，mA甲基化識別蛋白(YTHDF2)具有重要的作用。RIG-Ⅰ識別病毒RNA后，其分子構象發(fā)生改變，與線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)產(chǎn)生作用。MAVS進入線粒體，激活干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)，再經(jīng)過一系列的生化反應，生成干擾素(IFN-α/β)，并產(chǎn)生后續(xù)的抗病毒反應。鑒于中華鱉在該方向的研究尚存在空白，因此有必要針對上述因子開展相關研究。

綜上，本實驗旨在建立基于中華鱉胚胎肝成纖維細胞的體外分離培養(yǎng)體系，并在此基礎上，進一步采用RNA病毒模擬物——聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激該細胞，研究其對細胞形態(tài)和干擾素生成通路相關因子的影響，最終構建基于中華鱉胚胎肝成纖維細胞Poly I:C的刺激模型，為深入研究中華鱉抗病毒免疫調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用中華鱉胚胎由本實驗室自行孵化得到。

主要試劑包括：DMEM高糖培養(yǎng)基、D-Hanks緩沖液、胰蛋白酶、秋水仙素、二甲基亞砜(DMSO)和100×雙抗(500 U·mL青霉素和500 U·mL鏈霉素)，購于北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)，購于Bovogen公司；一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、一抗RIG-Ⅰ、一抗MAVS、一抗干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)、二抗HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG、RIPA裂解液和TBST緩沖溶液，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、TriZol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，購于美國Thermo Fisher公司；poly I:C，購于美國Sigma公司；Lipofectmine 3000試劑，購于美國Invitrogen公司；異丙醇，購于國藥集團化學試劑有限公司；PCR反應試劑，購于日本Takara公司；實時熒光定量PCR試劑UltraSYBR Mixture，購于江蘇康為世紀生物科技有限公司；臺盼藍染液、5×SDS-PAGE上樣緩沖液、ECL化學發(fā)光試劑盒，購于上海碧云天生物技術有限公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基和FBS按9∶1的比例混合后，再加入1%(體積分數(shù))的100×雙抗配制成完全培養(yǎng)基。

細胞凍存液由DMEM、FBS、DMSO按70%、20%、10%的比例(以質(zhì)量分數(shù)計)配制。

1.2 原代培養(yǎng)

取孵化至第23期的中華鱉胚胎，用75%(體積分數(shù))乙醇對殼表面進行消毒，然后移入細胞操作間，在無菌條件下用眼科剪剪破卵殼，取出胚胎肝組織，用D-Hanks緩沖液(含1×雙抗)清洗2遍以去除血細胞。之后，將其移入裝有500 μL 0.25%(質(zhì)量分數(shù)，下同)胰蛋白酶的1.5 mL離心管中，用眼科彎頭剪刀將組織塊剪成約1 mm的塊狀，再將其轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，加入3.5 mL 0.25%胰蛋白酶，混合后，在細胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化20 min(每隔5 min輕輕晃動1次)，再加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化。消化后用40 μm細胞過濾器過濾至新的50 mL離心管中，之后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000×離心10 min，棄上清后，將所得沉淀用適量的完全培養(yǎng)基懸浮后移入到25 cm的細胞培養(yǎng)瓶(T25)中，置細胞培養(yǎng)箱中31 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，隨后逐日在DM4000型顯微鏡(德國Leica)下觀察細胞貼壁和生長狀況，每2 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3 傳代培養(yǎng)

觀察原代細胞培養(yǎng)情況，待細胞鋪滿單層時，吸出舊培養(yǎng)基，用5 mL D-Hanks緩沖液清洗一次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化3 min，之后拍打培養(yǎng)瓶側壁使細胞脫壁，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶5的比例接種至75 cm的細胞培養(yǎng)瓶(T75)，置于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)。后續(xù)細胞傳代均按1∶5的比例進行。

1.4 細胞凍存與復蘇

選取形態(tài)均一、生長旺盛并處于指數(shù)生長期、細胞貼壁90%以上的1瓶細胞，利用0.25%胰蛋白酶使細胞脫落下來，隨即將細胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000×離心3 min以去除培養(yǎng)基與胰蛋白酶。加入適量預先配制好的細胞凍存液，輕輕吹打，混合均勻，顯微鏡觀察計數(shù)后，調(diào)節(jié)凍存液劑量，使細胞濃度達到10mL，轉(zhuǎn)移細胞至2 mL凍存管中，然后將其放在預冷的程序降溫盒(需加入異丙醇)中進行凍存。凍存程序如下：4 ℃存放6 h，之后轉(zhuǎn)移至-20 ℃放置24 h，再于-80 ℃放置24 h，最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

復蘇時，從液氮中取出凍存的細胞，快速置于37 ℃水浴鍋中，輕輕晃動凍存管使其快速解凍。完全融化的細胞懸液經(jīng)1 000 ×室溫離心5 min后棄上清，加入3 mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞后，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶，置于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。

取凍存前、后的細胞懸液，將其與0.4%(質(zhì)量分數(shù))臺盼藍染液按1∶4的比例混合后，滴加至血球計數(shù)板上進行細胞計數(shù)，在顯微鏡下觀察：死細胞被染成藍色，而活細胞則呈透明卵圓形。用活細胞占計數(shù)細胞的比例表示細胞存活率。

1.5 細胞生長曲線測定

將中華鱉胚胎肝成纖維細胞經(jīng)消化后制成終濃度為2×10mL的細胞懸液，接種至24孔培養(yǎng)板中，于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。自接種結束開始計時，于培養(yǎng)后8 d內(nèi)每天用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)每孔細胞的數(shù)量，每隔2 d給細胞換液1次。實驗重復3次，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以每1 mL培養(yǎng)液中的細胞數(shù)量為縱坐標，繪制生長曲線，并計算中華鱉細胞的倍增時間。

1.6 細胞染色體觀察與分子鑒定

取穩(wěn)定生長于6孔板48 h的第10代細胞，加入終濃度1 μg·mL的秋水仙素于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)6 h，用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化后回收細胞。經(jīng)低滲、預固定、固定、染色、干燥、封片后觀察。

選取生長良好的中華鱉胚胎肝成纖維細胞，消化后收集細胞沉淀，采用TriZol法提取細胞總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，參考曹代男等的方法對成纖維細胞做分子鑒定，以波形蛋白基因和肌動蛋白α2基因2作為鑒定因子，以基因作為對照因子(引物序列詳見表1)。PCR反應體系：5 μL 2×GC Buffer Ⅱ，1.6 μL dNTP Mixture，0.4 μL cDNA，0.4 μL上游引物(10 μmol·μL)，0.4 μL下游引物(10 μmol·μL)，0.2 μL TaKaRa LA酶，2 μL ddHO。PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃保溫。1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.7 Poly I:C轉(zhuǎn)染細胞

將中華鱉胚胎肝成纖維細胞經(jīng)消化后制成終濃度為1.5×10mL的細胞懸液，接種至12孔培養(yǎng)板中(每孔1 mL)，待生長至約80%時更換新鮮的完全培養(yǎng)基。采用Lipofectmine 3000試劑進行Poly I:C轉(zhuǎn)染，每孔加入1 μg Poly I:C，同時在對照組中加入相同體積的空白Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組和對照組各設3個重復，于細胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)24 h后收集各組細胞。收集時吸干培養(yǎng)基，加入200 μL RIPA裂解液，放置于冰上，在搖床上裂解處理30 min，轉(zhuǎn)移裂解液至EP管中,并加入80 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃金屬浴處理10 min后，3 000×、4 ℃離心10 min，然后吸取上清液用于Western blot檢測。

用于實時熒光定量PCR檢測的細胞采用6孔板進行Poly I:C轉(zhuǎn)染，收集細胞時先吸干培養(yǎng)基，再加入1 mL TriZol試劑，冰上處理10 min后，按TriZol試劑說明書中的方法提取總RNA，按1.6節(jié)方法制備cDNA。

1.8 實時熒光定量PCR檢測和Western blot檢測

采用UltraSYBR Mixture試劑，以-為內(nèi)參基因，使用MyiQ2 Two Color實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)測定-Ⅰ、和2的相對表達量(引物序列詳見表1)。實時熒光定量PCR反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。反應體系：6.25 μL 2×UltraSYBR Mixture，1.0 μL cDNA，0.25 μL上游引物(10 μmol·μL)，0.25 μL下游引物(10 μmol·μL)和4.75 μL ddHO。

用10%(質(zhì)量分數(shù))的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶，電泳結束后用濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%(體積分數(shù))脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h，再加入一抗在4 ℃孵育過夜，之后用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，再加入二抗于室溫下孵育1 h，用TBST緩沖液洗膜3次后，利用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色，最后在Amershan Imager 680系統(tǒng)(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB)上成像。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用Livak等的方法計算。采用Image-Pro Plus軟件量化Western blot圖像條帶的灰度值，獲得的數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件中進行統(tǒng)計，并開展獨立樣本檢驗，顯著性水平選定為α=0.05。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)24 h后可觀察到少量細胞貼壁，此時細胞多呈成纖維樣，細胞體積較小，細胞間隙較大(圖1)。148 h后，細胞在完全培養(yǎng)基中生長較好，貼壁細胞數(shù)目明顯增加，基本鋪滿單層，此時可以進行傳代培養(yǎng)。傳代細胞形態(tài)上與原代細胞一致，但細胞突起開始拉長，體積逐漸變大。傳代細胞增殖速度較快，2～3 d即可傳代一次。隨著傳代的進行，細胞生長逐漸趨于穩(wěn)定，至本研究成文時已成功傳至20代。

2.2 細胞凍存與復蘇

將凍存1個月的細胞從液氮中取出進行復蘇，培養(yǎng)2 d后在顯微鏡下進行觀察，細胞生長速度和形態(tài)與凍存前無明顯差別，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，細胞可鋪滿單層，且可以進行傳代培養(yǎng)。對冷凍前、后的細胞進行臺盼藍染色(圖2)，經(jīng)統(tǒng)計，細胞存活率分別為(90.51±0.46)%和(82.95±0.61)%。

圖1 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細胞形態(tài)Fig.1 Morphology of primary culture and subculture of fibroblast from embryonic liver of Chinese soft-shelled turtle

正常細胞染色后呈白色，死亡細胞染色后呈藍色。Living cells display white color， while the dead ones display blue color.圖2 中華鱉胚胎肝成纖維細胞凍存前(a)、后(b)臺盼藍染色結果Fig.2 Trypan blue staining of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle before (a) and after (b) cryopreservation

2.3 細胞生長曲線測定

中華鱉胚胎肝成纖維細胞的生長曲線呈典型的“S”形(圖3)，符合細胞生長的一般規(guī)律。接種后細胞先處于潛伏期，2～7 d進入對數(shù)生長期，8 d起細胞雖有生長，但速度減慢。經(jīng)計算，6代時細胞的倍增時間為59.9 h。

2.4 細胞染色體觀察和分子鑒定

選取100個中期分裂相的成纖維細胞(第10代)進行染色體觀察和數(shù)目統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目在66條的比例為72%(圖4)。PCR擴增后，獲得基因條帶和2基因條帶(圖5，分別對應于544 bp和628 bp處)。

2.5 Poly I:C轉(zhuǎn)染對中華鱉胚胎肝成纖維細胞的影響

圖3 中華鱉胚胎肝成纖維細胞的生長曲線Fig.3 Growth curve of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

圖4 中華鱉胚胎肝成纖維細胞染色體Fig.4 Chromosome of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

M，DNA分子量標準；1，ACTA2；2，VIM；3，GAPDH；4，H2O。M， DNA marker; 1， ACTA2; 2， VIM; 3， GAPDH; 4， H2O.圖5 中華鱉胚胎肝成纖維細胞的分子鑒定Fig.5 Molecular identification of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

用Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細胞，在31 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，大量細胞逐漸收縮成圓形，漂浮在培養(yǎng)瓶表面，而對照組的細胞仍密集均勻分布，細胞貼壁良好(圖6)。與對照組相比，Poly I:C轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了-Ⅰ基因的表達水平，而和2基因的表達量在Poly I:C轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)(圖7)。與對照組相比，Poly I:C轉(zhuǎn)染后，RIG-Ⅰ、MAVS蛋白表達水平顯著增加，而IRF1蛋白表達水平無顯著變化(圖8、表2)。

3 討論

目前，由于缺乏中華鱉來源的細胞系，中華鱉病毒學、免疫學，以及功能基因組學等方面的工作難以展開或進展緩慢。原代培養(yǎng)是細胞系建立中最為關鍵的一步，只有原代細胞分離成功，才有可能成功建立細胞系。目前，常用的原代細胞培養(yǎng)方法有直接提取法、消化分解法和組織塊培養(yǎng)法。其中，常用于龜鱉類細胞原代培養(yǎng)的方法主要是2類：一類是組織遷移法，一類是胰蛋白酶消化法。兩種方法均可成功獲得可傳代的細胞。胰蛋白酶消化法是一種常用的原代細胞培養(yǎng)方法，已在多個物種的原代培養(yǎng)中得到應用。本研究在胰蛋白酶消化法基礎上進行改進，采用40 μm細胞過濾器從組織中分離原代細胞，成功從中華鱉胚胎中分離、培養(yǎng)出肝成纖維細胞，得到了形狀、性能一致的細胞懸液，避免了培養(yǎng)液中大塊組織塊的存在，以及由此引起的多種細胞混雜，獲得的細胞可確定為單一的成纖維細胞。而且，本實驗分離培養(yǎng)出的細胞貼壁較快，細胞量大，生長情況良好。

圖6 Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細胞24 h后的形態(tài)Fig.6 Morphology of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C for 24 h

標*或**的分別表示對照組與轉(zhuǎn)染組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。* and ** indicate significant difference between the control group and the transfection group at P<0.05 and P<0.01， respectively.圖7 Poly I:C轉(zhuǎn)染對中華鱉胚胎肝成纖維細胞RIG-Ⅰ、m6A和YTHDF2基因相對表達量的影響Fig.7 Relative gene expression of RIG-Ⅰ， m6A and YTHDF2 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

圖8 Poly I:C轉(zhuǎn)染對中華鱉胚胎肝成纖維細胞RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1蛋白表達的影響Fig.8 Protein expression of RIG-Ⅰ， MAVS and IRF1 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

表2 Western blot條帶量化灰度值

在進行細胞原代培養(yǎng)操作時，如果組織滅菌不徹底，容易引起細胞培養(yǎng)污染。中華鱉胚胎以蛋的形式存在，作為原材料，具有蛋內(nèi)無菌、蛋表面滅菌操作容易的特點，操作相對簡便。此外，與成體相比，胚胎來源細胞分化能力強，活力好，生長快，傳代代數(shù)更多。本試驗獲得的細胞已傳20代，細胞活力正常。我們認為，選用鱉的胚胎來進行原代培養(yǎng)，是原代細胞培養(yǎng)成功的一個關鍵所在。

細胞體外培養(yǎng)會受到營養(yǎng)(糖、氨基酸、維生素等)和培養(yǎng)環(huán)境(溫度、CO濃度、滲透壓和pH等)的影響。中華鱉細胞培養(yǎng)中，常用的溫度包括25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃。本實驗參照郭海杰培養(yǎng)中華鱉心肌細胞的營養(yǎng)條件和環(huán)境，將培養(yǎng)溫度設定為31 ℃，選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，F(xiàn)BS質(zhì)量分數(shù)為10%。結果顯示，該條件下培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細胞貼壁和增殖迅速，傳代后細胞狀態(tài)穩(wěn)定，按1∶5比例進行傳代時，2～3 d即可傳代一次。

本實驗培養(yǎng)的細胞形態(tài)符合成纖維細胞形態(tài)學特征，初步鑒定為成纖維細胞。Wang等發(fā)現(xiàn)，錦鯉腦細胞在生長初期主要以成纖維細胞為主，但傳代至第20代時上皮樣細胞逐漸成為主要形態(tài)，因此僅憑形態(tài)學特征并不能準確判斷其為成纖維細胞，通常還需要結合其他的特異性鑒定方法。關于成纖維細胞的鑒定，目前多采用免疫熒光的方法進行鑒定。除此之外，也可以通過PCR法進行鑒定。一般認為，波形蛋白基因和肌動蛋白基因2是成纖維細胞重要的分化標記基因。主要負責維持細胞骨架的完整性，通常只在間充質(zhì)細胞中表達；2是細胞骨架微絲、微管，以及肌小節(jié)的主要組成部分，存在于細胞質(zhì)中。曹代男等采用和2鑒定紅耳龜胚胎的成纖維細胞。本實驗檢測到了和2的電泳條帶，證實分離培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。

細胞核型正常是細胞研究工作的基礎。針對細胞進行的克隆、基因編輯和轉(zhuǎn)基因等研究都需要核型正常的細胞。本研究所獲得的第10代細胞核型正常率為72%，表明培養(yǎng)的細胞狀態(tài)較好，屬于正常范疇。一般來說，隨著細胞傳代數(shù)的增加，細胞會越發(fā)衰老，核型異常的細胞比例會增大。本研究中細胞在第10代時核型正常比例仍較高，說明可用于后續(xù)研究。

干擾素生成通路的機制在前言中已做簡要介紹，本研究涉及的因子包括RIG-Ⅰ、mA、YTHDF2、MAVS和IRF1。根據(jù)已知物種的作用機制，對干擾素生成具有正向調(diào)節(jié)作用的包括RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1，具有反向調(diào)節(jié)作用的包括mA和YTHDF2。Poly I:C是一種模擬病毒RNA作用的雙鏈RNA模擬物，是實驗中常用的一種免疫刺激物。本研究中，Poly I:C轉(zhuǎn)染提高了RIG-Ⅰ的基因和蛋白表達水平，同時上調(diào)了MAVS蛋白的表達水平，而和2基因的表達水平則顯著降低。這表明，Poly I:C轉(zhuǎn)染下，干擾素生成通路被激活，且促進了干擾素的生成，進而可產(chǎn)生抑制病毒的作用。由此可知，中華鱉干擾素生成通路的機制與其他物種存在一致性。Vats等證實，Poly I:C刺激能夠顯著提高水牛()成纖維細胞-Ⅰ基因的表達水平。在水生動物中，Chen等研究表明，Poly I:C刺激草魚原代腎細胞24 h后，-Ⅰ基因的表達水平提高。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，過表達2顯著降低了Poly I:C誘導的干擾素調(diào)節(jié)因子3和干擾素基因-的表達水平。

本研究對干擾素生成通路進行Poly I:C刺激實驗時，檢測指標包括基因表達(-Ⅰ、和2)和蛋白表達(RIG-Ⅰ，MAVS和IRF1)，除了RIG-Ⅰ同時進行熒光定量PCR和Western blot檢測外，其他因子受限于現(xiàn)有的基因序列和抗體，均只進行一種檢測，但是基因表達和蛋白表達的單一結果也能夠說明因子的變化趨勢。

綜上，本實驗成功建立了中華鱉胚胎肝成纖維細胞的體外分離培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出的成纖維細胞具有可穩(wěn)定傳代、生長快和分化程度低等特點。在此基礎上，采用Poly I:C轉(zhuǎn)染的方法成功激活了細胞干擾素生成通路的相關因子，為后續(xù)該通路的研究提供了實驗材料。