蘇俐丹 何迎春 黃立中 劉 潔

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，長沙410208）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，發(fā)病率為頭頸部惡性腫瘤之首，目前治療以放療為主輔以化療和手術(shù)治療，但存在手術(shù)難度大、術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、放療后不良反應(yīng)嚴重等問題，因此，需尋找更有效且毒副作用小的藥物用于NPC 治療［1-2］。血根堿（san?guinarine，SAN）是來源于白屈菜及博落回等罌粟科植物的苯并菲啶類生物堿，有抗菌、消炎、殺蟲等多種藥理作用，并具有抗腫瘤作用［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬，但尚無關(guān)于SAN 對NPC細胞增殖及自噬影響的文獻。SAN 可抑制NPC 細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，本研究觀察了SAN 對NPC細胞增殖及自噬的影響，探討增殖與自噬的關(guān)系，并從AMPK 信號通路研究其作用機制，為SAN 治療NPC提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人NPC 細胞株5-8F 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司（批號：BNCC341932）；SAN（純度≥98%）購自上海源葉科技生物有限公司（批號：2447-54-3），稱取SAN 粉末20 mg，二甲基亞砜溶解，制成200 mmol/L 母液，-20 ℃避光保存，臨用前用RPMI1640 完全培養(yǎng)液稀釋；順鉑（cisplatin，上海源葉生物科技有限公司，批號：B24462）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號：SH30809.01B）；2.5 g/L 胰蛋白酶-EDTA 消化液（北京索萊寶公司，批號：T1320）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：10099-141）；MTT（碧云天生物科技有限公司，批號：ST316）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素（rapamycin）、AMPK抑制劑Compound C（MCE公 司，批 號：HY-19312-57232、HY-10219-61925、HY-13418-40374）；單丹磺酰戊二胺（MDC，北京索萊寶公司，批號：G0170）；BCA 蛋白定量試劑盒、凝膠配制試劑盒（康為世紀公司，批號：CW0014S-500T、CW0022S）；anti-β-actin、anti-PCNA、LC3、Beclin-1、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR（CST，批 號：4970、13110、4108、3495、23214、5831、2535、2983，1：1 000稀釋）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（CST，批號：75952）；賀利氏HERA cell 150i CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）；全自動酶標分析儀（ELX800，Bio Tek 公司）；實時無標記細胞分析技術(shù)（real time cellular analysis，RTCA，DP3*16，艾森生物科技公司）；Odys?sey多功能熒光成像系統(tǒng)（Olympus公司）；CytationTM5細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（Bio Tek 公司）；HT7700 透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NPC 細胞5-8F 培養(yǎng)瓶中加入6 ml 完全培養(yǎng)液后，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞密度達80%時進行傳代。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期5-8F細胞，制成5×104個/ml 單細胞懸液，接種于96 孔板（100 μl/孔）。細胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，分組，順鉑（0.004 g/L）為陽性對照組，每組5個復(fù)孔，藥液體積為200 μl/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h、36 h、48 h，棄培養(yǎng)液，100 μl/孔加入現(xiàn)配的MTT 溶液孵育3～4 h，全自動酶標分析儀檢測492 nm 處吸光度（OD），計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=1-（OD實驗組-OD空白孔）/（OD對照組-OD空白孔）×100%。

1.2.3 RTCA 檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期5-8F細胞消化，制成5×104個/ml單細胞懸液，接種于RTCA細胞增殖檢測培養(yǎng)板，參考胡晶等［5］方法，100 μl/孔加入細胞懸液，細胞生長到達平臺期前加入不同濃度藥物后繼續(xù)檢測72 h以上。

1.2.4 MDC 法檢測細胞自噬 取對數(shù)生長期5-8F細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板，細胞完全貼壁后棄舊培養(yǎng)液，按實驗分組分別處理24 h，參考藺婷等［6］方法，PBS 沖洗3 次，加入50 μmol/L MDC 溶液孵育40 min，棄MDC 溶液，PBS 洗滌3 次，熒光顯微鏡拍照，Image Prox Plus軟件計算熒光強度。

1.2.5 透射電鏡觀察自噬形成情況 取對數(shù)生長期5-8F細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶，細胞貼壁后根據(jù)分組處理24 h，參考藺婷等［6］方法制成單細胞懸液，裝入1.5 ml離心管，2 000 r/min離心6 min，棄上清，1 ml PBS 重懸2 次，離心，棄上清，各離心管中加入1 ml 2.5%戊二醛，4 ℃固定4～6 h，1%鋨酸固定液固定2 h，梯度丙酮脫水，浸透，包埋，固化，超薄切片，3%醋酸鈾和硝酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達 各組5-8F 細胞培養(yǎng)24 h 后冰上裂解30 min，離心，取上清，BCA 法定量，按80 μg 配樣，上樣后進行SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，含50 g/L脫脂牛奶的TBST中封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，室溫孵育二抗2 h，Odyssey多功能熒光成像儀掃膜，Image studio軟件框選條帶信號值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS23.0 及Gragh Pad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和制圖，實驗重復(fù)3 次。本研究為單因素方差設(shè)計，計量資料如服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，多重比較滿足方差齊性，則采用LSD 檢驗，方差不齊者采用Dunnet T3 檢驗。不服從正態(tài)分布則采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1 SAN抑制5-8F細胞增殖

2.1.1 MTT 檢測SAN 對5-8F 細胞增殖的影響5-8F 細胞經(jīng)不同濃度SAN 處理24 h、36 h、48 h，與Control 組相比，SAN 可顯著抑制5-8F 細胞增殖，且呈劑量依賴性（P＜0.01，圖1）。

圖1 MTT法檢測SAN對5-8F細胞增殖的影響Fig.1 Inhibition of SAN on proliferation of 5-8F cells by MTT

2.1.2 RTCA 檢測SAN 對5-8F 細胞增殖的影響不同濃度SAN均可抑制5-8F細胞增殖（圖2）。RTCA、MTT 實驗結(jié)果一致。根據(jù)增殖抑制實驗結(jié)果，選擇有顯著抑制作用的較低濃度的SAN（2.5、5 μmol/L）進行后續(xù)實驗，處理時間為24 h。

圖2 RTCA檢測SAN對5-8F細胞增殖的影響Fig.2 Inhibition of SAN on proliferation of 5-8F cells by RTCA

2.1.3 Western blot 檢測SAN 對5-8F 細胞PCNA 蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，SAN（2.5、5 μmol/L）處理5-8F 細胞24 h 后，與Control 組相比，SAN降低了PCNA表達（P＜0.01，圖3）。

圖3 SAN對5-8F細胞PCNA蛋白的影響Fig.3 Effect of SAN on expression of PCNA protein in 5-8F cells

2.2 SAN對5-8F細胞自噬的影響

2.2.1 MDC 檢測SAN 對5-8F 細胞自噬的影響MDC 結(jié)果顯示，與Control 組相比，SAN 處理5-8F 細胞24 h 后，SAN 2.5、5 μmol/L 組平均熒光強度均增強（P＜0.01，圖4），表明細胞自噬效應(yīng)增強。

圖4 MDC檢測SAN對5-8F細胞自噬的影響（×20）Fig.4 Effect of SAN on autophagy of 5-8F cells by MDC（×20）

2.2.2 透射電鏡觀察SAN 對5-8F 細胞自噬的影響 Control 組細胞結(jié)構(gòu)完整，無自噬小體形成；與Control 組比較，SAN 組及自噬激活劑Rapamycin 組（陽性對照）細胞內(nèi)形成大量自噬小體（箭頭所示，圖5），表明SAN誘導(dǎo)了NPC細胞自噬。

圖5 透射電鏡觀察細胞自噬體形成情況（×20 000）Fig.5 Observation of autophagosome formation by TEM（×20 000）

2.2.3 SAN 對5-8F 細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組比較，SAN組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達升高（P＜0.01，P＜0.05），p62蛋白表達降低（P＜0.01，圖6）。提示SAN可誘導(dǎo)NPC細胞自噬。

圖6 SAN對5-8F細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響Fig.6 Effect of SAN on expressions of autophagy-related proteins in 5-8F cells

2.3 自噬在SAN抑制5-8F細胞增殖中的作用

2.3.1 MDC 檢測3-MA 預(yù)處理對SAN 誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬的影響 MDC結(jié)果顯示，與SAN組相比，3-MA（自噬抑制劑）預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)的熒光強度降低（P＜0.01，圖7），提示抑制自噬后，SAN 誘導(dǎo)NPC 細胞自噬的作用減弱。

圖7 MDC 檢測3-MA 對SAN 誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬的影響（×20）Fig.7 Effect of SAN combined with 3-MA on autophagy of 5-8F cells by MDC（×20）

2.3.2 透射電鏡觀察細胞自噬體 透射電鏡結(jié)果顯示，與SAN組比較，3-MA預(yù)處理后，SAN誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬小體明顯減少（圖8）。提示抑制自噬后，SAN誘導(dǎo)NPC細胞自噬的作用減弱。

圖8 透射電鏡觀察3-MA 對SAN 誘導(dǎo)細胞自噬體形成的影響（×5 000）Fig.8 Observation of effect of SAN on autophagosome formation induced by 3-MA by TEM（×5 000）

2.3.3 3-MA 對SAN 抑制5-8F 細胞增殖的影響MTT 和RTCA 結(jié)果一致：與SAN 組比較，3-MA 預(yù)處理后，SAN 對細胞增殖的抑制作用減弱。提示抑制自噬后，SAN抑制NPC細胞增殖的作用減弱（圖9）。

圖9 3-MA聯(lián)合SAN對5-8F細胞增殖的影響Fig.9 Effect of 3-MA combined with SAN on proliferation of 5-8F cells

2.3.4 Western blot 檢測3-MA 預(yù)處理對SAN 調(diào)控5-8F 細胞增殖和自噬蛋白表達的影響 與SAN 組相比，3-MA 預(yù)處理后，SAN 上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達、下調(diào)p62、PCNA蛋白表達的作用減弱（P＜0.01，圖10）。提示抑制自噬后，SAN 抑制增殖蛋白表達的作用降低。

圖10 3-MA 聯(lián)合SAN 對5-8F 細胞增殖和自噬蛋白表達的影響Fig.10 Effect of 3-MA combined with SAN on proliferation and autophagy protein expression of 5-8F cells

2.4 SAN 通過AMPK/mTOR 通路誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬抑制細胞增殖

2.4.1 SAN 對AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響 SAN 處理24 h 后，與Control 組相比，AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白AMPK、p-AMPK 表達上調(diào)，mTOR 表達下調(diào)（P＜0.01，圖11），表明SAN能激活A(yù)MPK/mTOR信號通路。

圖11 SAN對AMPK/mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響Fig.11 Effect of SAN on expressions of key proteins in AMPK/mTOR signaling pathway

2.4.2 AMPK/mTOR 通路在SAN 誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬抑制細胞增殖中的作用 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，AMPK/mTOR 信號通路抑制劑Compound C 可 降 低AMPK、p-AMPK 表 達，升 高mTOR 表達（P＜0.01）；而AMPK 激活劑Rapamycin可升高AMPK、p-AMPK 表達，降低mTOR 表達（P＜0.01）；與SAN 組比較，Compound C 預(yù)處理后，SAN上調(diào)AMPK、p-AMPK 表達、抑制mTOR 表達的作用減弱（P＜0.01，圖12A），提示抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 激活A(yù)MPK/mTOR 信號通路的作用降低。MDC 結(jié)果顯示，與SAN 組相比，AMPK 抑制劑Compound C 預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)自噬效應(yīng)明顯減弱（P＜0.01，圖12B），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 誘導(dǎo)自噬效應(yīng)降低。與SAN 組比較，Com?pound C 預(yù)處理后，SAN 上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1 蛋白 表 達、下 調(diào)p62 表 達 的 作 用 減 弱（P＜0.01，圖12C），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN正調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的作用降低。與SAN 組比較，Compound C 預(yù)處理后，SAN 組細胞增殖抑制作用減弱，下調(diào)PCNA 蛋白表達的作用也減弱（圖12D、E），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 抑制細胞增殖的作用降低。

圖12 AMPK/mTOR 通路在SAN 誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬抑制細胞增殖中的作用Fig.12 Role of AMPK/mTOR pathway in SAN induced autophagy and inhibition of cell proliferation in 5-8F cells

3 討論

NPC 發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤首位，且易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［7］。腫瘤細胞無限分裂增殖是腫瘤生長過程中的一種常見生物學(xué)行為，抑制腫瘤細胞增殖可抑制腫瘤細胞生長和浸潤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可抑制多種腫瘤細胞增殖，包括肺癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等［8］，SAN 與NPC 細胞的關(guān)系研究尚未見報道。MTT 和RTCA 結(jié)果顯示，SAN 處理細胞后，5-8F 細胞增殖率降低，PCNA 蛋白表達下降，即SAN可抑制NPC細胞增殖。

自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是一種廣泛存在于真核生物細胞、進化上高度保守的細胞降解過程［9］。自噬具有雙重性，正常范圍的自噬對細胞生長有保護和修復(fù)作用，而過度自噬通過破壞細胞內(nèi)正常蛋白和細胞器導(dǎo)致不可逆損傷和死亡，誘發(fā)細胞凋亡與壞死［10］。近年以自噬為靶點的抗腫瘤藥物誘發(fā)NPC 細胞過度自噬，繼而引起細胞死亡成為研究熱點。微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）參與自噬過程，自噬發(fā)生時，自噬小體吞噬胞質(zhì)成分，包括胞質(zhì)蛋白和細胞器，同時將胞質(zhì)形式LC3（LC3Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，形成LC3-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)物（LC3 Ⅱ），將其募集至自噬體膜［11］。LC3Ⅱ作為自噬的標志分子，其表達與自噬活性呈正相關(guān)［12-14］。Beclin-1 是自噬相關(guān)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1 過表達通過人類滑膜肉瘤細胞的自噬依賴性途徑抑制腫瘤細胞增殖和存活，同時，LC3Ⅱ表達升高，而p62 表達降低，Beclin-1 過表達的細胞中發(fā)現(xiàn)多個自噬體，表明其自噬活性增強［15］。泛素化結(jié)合蛋白（sequestosome 1，SQSTM1/p62）是一種磷酸化蛋白，作用域?qū)挿海c腫瘤細胞活性呈正相關(guān)［16］。目前對SAN 抗腫瘤作用機制的研究主要涉及抑制增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤血管生成、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等，近期研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可通過抑制ROS，激活ERK1/2 誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細胞自噬［17］。徐加英［18］發(fā)現(xiàn)，SAN 可誘導(dǎo)宮頸癌細胞自噬，自噬抑制劑可削弱SAN 抑制宮頸癌HeLa細胞和Siha細胞增殖的作用，自噬相關(guān)蛋白LC3 和Beclin-1 參與這一過程。AMPK 是細胞的能量傳感器和營養(yǎng)通路激活的主要成分，可調(diào)節(jié)細胞增殖、生長和自噬。姚宗花等［19］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，吉馬酮通過激活A(yù)MPK 信號通路，抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖，促進其凋亡，提高LC3 含量而促進自噬。李沫等［20］發(fā)現(xiàn)，CCAT1 過表達可能通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制宮頸癌HeLa 細胞自噬。

本研究顯示，SAN 處理NPC 細胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達上調(diào)，p62表達下調(diào)。同時MDC染色法和透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAN 作用5-8F 細胞24 h后，與溶劑組比較，5-8F 細胞呈明顯自噬，說明SAN具有誘導(dǎo)NPC 細胞自噬的作用。3-MA 是一種自噬抑制劑，3-MA 預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)的細胞自噬效應(yīng)減弱，表明SAN 能夠誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬，而抑制自噬后，SAN 誘導(dǎo)5-8F 細胞自噬的作用減弱。同時，SAN 對5-8F 細胞增殖的抑制效應(yīng)被削弱。為進一步探究SAN 誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制，檢測AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白表達，發(fā)現(xiàn)SAN 可激活A(yù)MPK/mTOR 通路，抑制AMPK 后，SAN 誘導(dǎo)細胞自噬的作用減弱，同時，SAN 對細胞增殖的抑制作用降低。

綜上，SAN 可通過誘導(dǎo)細胞自噬抑制NPC 細胞增殖，其機制可能與激活A(yù)MPK/mTOR 信號通路有關(guān)。