盧清俠，金前躍，馮麗麗，柴永笑，5，郭振華，邢廣旭，張改平

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3. 江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；4. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002；5. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

禽心包積液-肝炎綜合征（Hydropericardiumhepatitis syndrome，HHS）是一種由禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV4）引起的急性傳染病[1]，主要臨床癥狀表現(xiàn)為病雞精神萎靡、嗜睡、食欲不振、拉綠色糞便，死亡率可達30%～80%，剖檢可見病死雞心包膜內(nèi)出現(xiàn)大量淡黃色液體，肝臟發(fā)黃、腫大等。由于該病于1987年首次暴發(fā)于巴基斯坦的安卡拉地區(qū)，因此，也被稱為“安卡拉”病。此后逐漸蔓延至世界多個國家和地區(qū)[2-4]。我國于2015 年7 月份左右首先在山東、河南等地暴發(fā)該病，隨后全國多個地區(qū)先后報道了該病的出現(xiàn)，其導(dǎo)致的高死亡率對養(yǎng)雞業(yè)造成了沉重的打擊[5-10]。該病主要感染3～5 周齡的肉雞，也可感染蛋雞、鴨、鵝、鴿等[11-13]。同時，該病還會與其他禽病出現(xiàn)混合感染，秦玉華[14]通過臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV4和雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、雞傳染性貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV）發(fā)生混合感染的比例較高。因此，精準快速的診斷對于臨床該病的預(yù)防和控制尤為重要。

目前，針對禽腺病毒的檢測方法較多，其中病毒分離鑒定、血清中和試驗、瓊脂擴散試驗等傳統(tǒng)檢測方法雖具有一定的優(yōu)勢，但由于檢測周期長、操作繁瑣等，不適用于臨床大規(guī)模檢測應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)常作為疾病早期快速診斷的有力工具，其中PCR技術(shù)，特別是近年來發(fā)展迅速的熒光定量PCR，因其靈敏度高、特異性好、檢測速度快和檢測通量大等優(yōu)點，適合大規(guī)模樣本早期快速診斷。唐熠等[15]通過對建立的PCR、Real-time PCR、套式PCR 和LAMP 等4 種檢測Ⅰ群禽腺病毒核酸的方法進行比較，發(fā)現(xiàn)Real-time PCR 檢測具有最高的靈敏度。招麗嬋等[16]針對Hexon基因建立了檢測FAdV4 的TaqMan 熒光定量PCR 方法，其最低檢測限為7.3×101拷貝/μL。劉琳等[17]也建立了最低檢測限為5.0×101拷貝/μL 的TaqMan 熒光定量檢測方法。但由于特異性探針的使用，其檢測費用相較于SYBR Green染料法更高，這也成為其臨床大規(guī)模應(yīng)用的短板。

為了建立一種特異、敏感和廉價的FAdV4 臨床檢測方法，本研究基于不同血清型毒株Hexon基因的堿基差異[18]，針對FAdV4Hexon基因保守區(qū)域進行擴增，以期建立一種熒光定量PCR 檢測方法，為FAdV4 臨床大規(guī)模早期快速診斷、疫病凈化以及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 病毒和細胞

FAdV4 ZZ 株（GenBank 登 錄號：MN337322.1）由本實驗室分離鑒定并保存，禽腺病毒血清8b 型（FAdV8b）、禽腺病毒血清11 型（FAdV11）、低致病性禽流感H9病毒（H9N2）、雞新城疫病毒（NDV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）、雞馬立克氏病毒（MDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）以及雞肝癌細胞系（LMH）均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自Roche 公司；病毒基因組提取試劑盒（MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、DL2000和DL5000 DNA Marker購自TAKARA 公司；Q5?超 保 真2× 預(yù) 混 液 購 自NEW ENGLAND BIOLABS 公司；pEASY?-Blunt Cloning Kit 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；通用型DNA 純化回收試劑 盒（Universial DNA Purificitation Kit）購 自TIANGEN 公 司；DME/F12 培 養(yǎng) 基 購 自HyClone 公司；青鏈霉素混合液和胰蛋白酶購自Solarbio 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；0.22 μm 濾器購自Merck Millipore公司。

1.3 引物設(shè)計

參考GenBank 公布的FAdV4 全基因組序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計FAdV4Hexon基因擴增引物（Hexon-F/R）和熒光定量PCR 引物（HeDL-F/R），片段大小分別為2 814 bp 和95 bp（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.4 病毒核酸提取

將試驗所需病毒液反復(fù)凍融3 次后10 000 r/min 離心5 min，取上清液200 μL，按照TAKARA MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit 產(chǎn)品說明書進行DNA抽提。

1.5 標(biāo)準品的制備

以FAdV4 DNA 為模板，利用Hexon-F/R 引物進行PCR 擴增。反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL、模板1 μL、上下游引物各1 μL，滅菌超純水加至20 μL，于PCR 儀上進行擴增。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù) 變 性5 min；98 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；停止于16 ℃。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。陽性PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，與pEASY-Blunt 載體進行連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆后進行菌液PCR 鑒定及測序分析。將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pEASY-Blunt-Hexon，并利用擴增引物和定量引物分別進行PCR鑒定。

使用超微量分光光度計NanoDrop 2000 對陽性質(zhì)粒標(biāo)準品進行濃度測定，并計算DNA拷貝數(shù)。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準曲線的建立

將標(biāo)準品質(zhì)粒依次做10 倍梯度稀釋，得到102—108拷 貝/μL 的 質(zhì) 粒，以 此 作 為 模 板，采 用SYBR Green Master（ROX）中建議的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行熒光定量PCR 反應(yīng)，并利用軟件進行分析，繪制標(biāo)準曲線。

1.7 敏感性試驗

將標(biāo)準品質(zhì)粒pEASY-Blunt-Hexon進行10 倍梯度稀釋至101—107拷貝/μL作為模板，以無菌無酶水作為陰性對照，進行SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR反應(yīng)，每個濃度設(shè)3次重復(fù)，同時使用相同濃度的質(zhì)粒進行常規(guī)PCR 反應(yīng)，比較2 種方法的敏感性。

1.8 特異性試驗

選取部分禽源病毒，包括禽腺病毒血清8b 型、禽腺病毒血清11型、低致病性禽流感H9病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性法氏囊病毒、雞馬立克氏病毒和雞傳染性支氣管炎病毒，利用試劑盒進行核酸抽提，分別取等量的核酸作為模板進行熒光定量PCR檢測，以FAdV4 病毒DNA 為陽性對照、無菌無酶水為陰性對照，每個樣品做3個重復(fù)，考察檢測方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗

分別取標(biāo)準品濃度為7.1×107、7.1×106、7.1×105、7.1×104、7.1×103拷貝/μL的樣品作為模板，進行批內(nèi)重復(fù)性試驗，即1 次檢測進行3 個重復(fù)；批間重復(fù)性試驗以上述樣品為模板，進行3 次獨立的熒光定量PCR 檢測。最后根據(jù)Ct值計算其變異系數(shù)，驗證檢測體系的重復(fù)性。

1.10 病毒增殖檢測

將FAdV4 ZZ 株接種于12 孔板單層LMH 細胞中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h 收集細胞與培養(yǎng)液于干凈的2 mL 離心管中，反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min離心5 min，將所收集的病毒液于超凈臺中過0.22 μm濾器，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用上述核酸提取方法對各時間點病毒進行核酸提取，并應(yīng)用建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法對其進行檢測。

同時，取各時間點病毒液做連續(xù)10 倍稀釋，并將稀釋好的病毒接種于長滿LMH 細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板上，每個稀釋度接種一縱排8 孔，每孔100 μL，逐日觀察細胞病變并記錄結(jié)果，觀察5～7 d，最后根據(jù)Reed-Muench 法計算TCID50。對上述2種方法的檢測結(jié)果進行比較，分析FAdV4 ZZ 株在LMH細胞上的增殖特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR標(biāo)準質(zhì)粒的制備

將測序正確的標(biāo)準質(zhì)粒pEASY-Blunt-Hexon利用擴增引物和定量引物分別進行PCR 擴增，結(jié)果如圖1 所示，擴增片段大小分別為2 814 bp 和95 bp左右，與預(yù)期片段大小一致，該結(jié)果表明成功構(gòu)建了pEASY-Blunt-Hexon陽性質(zhì)粒標(biāo)準品。

圖1 pEASY-Blunt-Hexon陽性質(zhì)粒標(biāo)準品鑒定Fig.1 Identification of pEASY-Blunt-Hexon positive plasmid standards

使用試劑盒提取陽性標(biāo)準品質(zhì)粒，利用NanoDrop 2000 測定其質(zhì)量濃度為52.9 ng/μL，計算出其拷貝數(shù)為7.1×109拷貝/μL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準曲線的建立

將標(biāo)準品進行10倍梯度稀釋，并對濃度為7.1×102—7.1×108拷貝/μL 的標(biāo)準品進行熒光定量PCR檢測，每個濃度設(shè)3 個重復(fù)，生成標(biāo)準曲線（圖2）。標(biāo)準曲線的回歸方程：y=-3.319x+38.737，R2=0.999，擴增效率（E）為100.122%。從溶解曲線（圖3）可以看出，所有標(biāo)準樣品均在78 ℃出現(xiàn)單一峰，表明反應(yīng)沒有引物二聚體和非特異性擴增。

圖2 FAdV4熒光定量PCR標(biāo)準曲線Fig.2 Standard curve for fluorescent quantitative PCR of FAdV4

圖3 FAdV4 熒光定量PCR溶解曲線Fig.3 Solubilization curves for fluorescence quantitative PCR of FAdV4

2.3 熒光定量PCR敏感性試驗結(jié)果

從圖4 可以看出，本研究建立的熒光定量PCR檢測方法最低檢測限為7.1×102拷貝/μL；而對相同模板所進行的常規(guī)PCR 結(jié)果顯示，其檢出的最低模板量為7.1×104拷貝/μL（圖5）。表明本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法的靈敏度為常規(guī)PCR 的100倍。

圖4 FAdV4熒光定量PCR檢測靈敏度Fig.4 The sensitive assay of fluorescence quantitative PCR of FAdV4

圖5 FAdV4常規(guī)PCR檢測靈敏度Fig.5 The sensitive assay of conventional PCR of FAdV4

2.4 熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

利用所建立的熒光定量PCR 方法，在相同的體系及反應(yīng)條件下，分別以FAdV4、FAdV8b、FAdV11、AIV（H9N2）、NDV、IBDV、MDV、IBV 的DNA 或cDNA 為模板，無菌無酶水為陰性對照，進行熒光定量PCR 檢測，結(jié)果顯示，除FAdV4 有明顯的擴增曲線外，其他7 種病毒檢測結(jié)果均為陰性（圖6）。表明本研究建立的方法具有良好的特異性。

圖6 FAdV4熒光定量PCR檢測特異性Fig.6 The specific assay of fluorescence quantitative PCR of FAdV4

2.5 熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

選取5 個標(biāo)準品分別進行批內(nèi)（表2）和批間（表3）重復(fù)性試驗，對其結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間標(biāo)準偏差均小于0.4，變異系數(shù)均小于2%，證明本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性良好。

表2 熒光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.2 Intra-assay reproducibility of fluorescent quantitative PCR

表3 熒光定量PCR批間重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.3 Inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative PCR

2.6 病毒增殖檢測結(jié)果

對不同時間點所收集的病毒液進行核酸提取后，采用建立的熒光定量PCR 方法進行病毒拷貝數(shù)檢測，同時使用相同的病毒液進行TCID50測定，根據(jù)結(jié)果繪制曲線（圖7）。結(jié)果顯示，隨著病毒在細胞上增殖時間的延長，2 種方法所檢測的結(jié)果均呈上升趨勢，表明建立的熒光定量PCR 方法可用于病毒增殖的檢測。

圖7 FAdV4 ZZ株在LMH細胞上增殖后病毒滴度和病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果Fig.7 Detection of virus titer and virus copy number of FAdV4 ZZ strain after proliferation on LMH cells

3 結(jié)論與討論

2015 年以來，隨著Ⅰ群禽腺病毒在我國雞群中的不斷蔓延流行，該病已成為當(dāng)前危害我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[19]，尤其HHS 通常以急性感染為主，臨床上具有傳播速度快、流行范圍廣和死亡率高的特點[20]。目前，熒光定量PCR 檢測方法被廣泛應(yīng)用于動物疫病檢測，特別是病毒性疾病的實驗室檢測，其不僅具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，還可以快速、準確地對病毒核酸進行定量[21]。常用的熒光定量PCR 技術(shù)主要有TaqMan 探針法和SYBR Green Ⅰ熒光染料法。TaqMan 探針法雖然具有高特異性和高靈敏性的特點，但熒光探針的使用也不可避免地增加了檢測的成本。

本研究通過對FAdV4Hexon基因序列進行分析，針對其保守區(qū)域設(shè)計引物，成功建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 檢測方法，該檢測方法與常規(guī)PCR 相比，不僅極大縮短了檢測時間，而且靈敏性提高，最低檢測限為7.1×102拷貝/μL；但與已有的探針法熒光定量檢測方法相比[15，16]，靈敏度略低，提示在引物設(shè)計方面還有進一步優(yōu)化的空間。同時，也應(yīng)注意到染料法熒光定量檢測方法中，SYBR Green Ⅰ染料與雙鏈DNA 的結(jié)合是非特異性的，這就要求引物設(shè)計時需特別注意避免引物二聚體的產(chǎn)生，以免引起假陽性的產(chǎn)生。本研究設(shè)計的引物在75～85 ℃出現(xiàn)單一的主峰，兩側(cè)無雜峰出現(xiàn)，說明不存在引物二聚體的產(chǎn)生和非特異性的擴增。本研究進一步評估了建立的熒光定量PCR檢測方法的特異性和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，建立的檢測方法不與FAdV8b、FAdV11、AIV（H9N2）、NDV、IBDV、MDV、IBV 等病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，批間重復(fù)分析顯示變異系數(shù)均小于2%，提示本研究建立的檢測方法具有良好的特異性和重復(fù)性。流行病學(xué)研究表明，我國流行的HHS 和包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）主要由Ⅰ群禽腺病毒的4 型（FAdV4）、8b 型（FAdV8b）以及11 型（FAdV11）引起[22-25]，因此選擇FAdV8b、FAdV11 血清型用于熒光定量PCR 特異性考察，結(jié)果表明，該方法可用于臨床多種血清型混合感染時FAdV4 的鑒別診斷。此外，利用建立的熒光定量PCR 檢測方法，評估了細胞培養(yǎng)液中病毒DNA 的含量，發(fā)現(xiàn)本方法測定的病毒DNA 含量與細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度之間具有良好的相關(guān)性。因此，本研究建立的檢測方法為快速評估病毒體外培養(yǎng)物和臨床樣品中的病毒載量提供了技術(shù)支撐。

綜上所述，本研究建立了快速、特異和穩(wěn)定的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 檢測方法，為FAdV4臨床早期快速鑒別診斷、流行病學(xué)監(jiān)測以及生物學(xué)研究提供了良好的技術(shù)支撐。