張 慧，高 潔，劉 爽，鄭 輝，董雅琴，李曉成，魏 榮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.西北農(nóng)林科技大學，陜西楊凌 712100）

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica）可引起豬的萎縮性鼻炎和支氣管肺炎，是豬呼吸道綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要致病因子之一。支氣管敗血波氏桿菌多呈散發(fā)或地方性流行，可通過空氣、豬群間的接觸或排泄物傳播，帶菌母豬通過接觸可經(jīng)呼吸道傳給仔豬。該菌可感染任何年齡的豬，以仔豬易感性最大[1]。化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes），又稱化膿放線桿菌，是一種機會致病菌，常引起豬、牛、羊等動物的肺炎、乳房炎、心內(nèi)膜炎、關節(jié)炎、皮下膿腫等疾病，嚴重時可引發(fā)膿毒敗血癥而導致家畜死亡[2]。世界范圍內(nèi)，歐洲國家以及日本、巴西、美國均有該菌感染的報道[3]。目前國內(nèi)外尚未見關于支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染豬的報道。本研究通過對2020 年11 月發(fā)生在陜西省某豬場的疫情進行病原檢測，分離到支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌，隨后進行敏感藥物篩選，以期為豬支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料

根據(jù)病料送檢信息，陜西省某豬場保育仔豬突然發(fā)病死亡，死亡前伴有咳嗽、氣喘癥狀。臨床診斷疑似為副豬嗜血桿菌或者豬胸膜肺炎放線桿菌感染。采集病死豬肺臟樣品，送中國動物衛(wèi)生與流行病學中心畜病監(jiān)測室進行細菌分離鑒定。

1.2 試劑

快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自濟凡生物科技有限公司；5%綿羊血平板，購自青島海博生物公司；TSA、TSB 培養(yǎng)基，購自美國BD 公司；胎牛血清，購自杭州四季青公司；2×TaqPCR Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、一步法熒光定量RT-PCR 試劑盒，購自TAKARA 公司；藥敏試劑（包括克林霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、諾氟沙星、頭孢唑啉、卡那霉素、頭孢曲松、慶大霉素、氨芐西林、多黏菌素B、頭孢哌酮、紅霉素）、細菌生化鑒定管，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 病原檢測

將送檢的病料分為兩份，一份經(jīng)組織研磨后，用快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒提取核酸進行病毒及支原體檢測；一份用于細菌分離鑒定。

1.3.1 病毒及支原體檢測 依據(jù)GB/T 35912—2018、GB/T 35911—2018、GB/T 35901—2018、GB/T 27540—2011、GB/T 35909—2018[4-8]中檢測規(guī)程，分別對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬瘟病毒、豬肺炎支原體進行熒光定量PCR 或常規(guī)PCR 檢測。

1.3.2 細菌分離純化及染色鏡檢 將送檢的病料無菌劃線接種于5%綿羊血平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察細菌菌落形態(tài)；挑取單菌落至含5%胎牛血清的TSB 培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)，同時對分離菌進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。

1.3.3 生化試驗鑒定 將新鮮培養(yǎng)的菌液接種至不同細菌微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄結果，參照細菌生化鑒定手冊進行判定。

1.3.4 16S rDNA PCR 測序 以煮沸法提取細菌DNA 模板。具體步驟：挑取新鮮培養(yǎng)菌落，加入200 μL 無菌雙蒸水混勻后，在沸水中煮沸10 min；冰浴后4 ℃ 12 000 r/min 離心，取上清液作為PCR 反應模板。參照文獻[9]中的細菌16S rDNA 通用引物序列（F27：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；R1492：5'-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'）進行擴增，擴增片段大小約1 500 bp。引物由深圳華大基因股份有限公司合成。反應體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL，模板1.5 μL，加無菌雙蒸水補足至25.0 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。將單一目的條帶PCR 產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司測序，并將測序結果在GenBank 中開展比對。

1.4 藥敏試驗

根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的Kirby-Bauer 紙片擴散法（K-B 紙片法）和判定標準，開展對12 種抗菌藥物的藥敏試驗。用滅菌棉拭子蘸取若干單菌落至1 mL 生理鹽水中稀釋，將菌液濃度調(diào)整至0.5 麥氏比濁度；另取滅菌棉拭子浸潤菌懸液，在含有5%胎牛血清的TSA 平皿上均勻涂布；待菌液吸收后，貼藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄結果。

2 結果

2.1 病毒及支原體檢測

經(jīng)檢測，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬瘟病毒及豬肺炎支原體均為陰性。

2.2 細菌分離培養(yǎng)

經(jīng)過細菌分離純化，從病死仔豬肺臟中分離到2 株細菌，分別命名為L1、L2。菌株L1 在5%綿羊血平板上溶血不明顯，呈現(xiàn)光滑、濕潤、邊緣整齊、乳白色菌落，菌落直徑為0.5～1 mm（圖1-A）；菌株L2 在5%綿羊血平板上呈β 溶血，呈現(xiàn)光滑、濕潤、邊緣整齊的針尖狀乳白色菌落（圖1-B）。革蘭氏染色及鏡檢結果顯示，L1 為陰性短桿菌（圖1-C），L2 為陽性短桿菌（圖1-D）。

2.3 生化試驗鑒定

生化試驗結果（表1～2）顯示：菌株L1 對葡萄糖、蔗糖、甘露醇等7 種糖醇的分解試驗均為陰性，觸酶、氧化酶試驗均為陽性，能分解尿素，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，不能分解七葉苷；菌株L2 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖和麥芽糖，不能發(fā)酵棉籽糖、甘露醇，可發(fā)酵山梨醇，觸酶試驗為陰性，不能分解尿素和七葉苷，不產(chǎn)生吲哚，不還原硝酸鹽。經(jīng)比對，上述兩種菌株生化試驗特性分別與支氣管敗血波氏桿菌（L1）和化膿隱秘桿菌（L2）相符合。

表1 分離菌L1 的生化反應特性

表2 分離菌L2 的生化反應特性

2.4 16S rDNA PCR 檢測及測序

對兩株分離菌分別進行細菌16S rDNA PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物均在1 500 bp 處出現(xiàn)明顯的目的條帶（圖2）。將PCR 產(chǎn)物測序后并經(jīng)Blast 比對，發(fā)現(xiàn)菌株L1、L2 的16S rDNA 序列與支氣管敗血波氏桿菌、化膿隱秘桿菌同源性均達100%。

2.5 藥敏試驗

K-B 紙片法藥敏試驗結果（表3）顯示，支氣管敗血波氏桿菌對氨芐西林和克林霉素有較強的耐藥性，對頭孢唑啉和頭孢曲松中度敏感，對其余藥物均為高度敏感；化膿隱秘桿菌對12 種抗菌藥中的4 種（四環(huán)素、多黏菌素B、紅霉素和克林霉素）有較強的耐藥性，對環(huán)丙沙星和諾氟沙星中度敏感，對其余藥物均為高度敏感。

表3 兩株分離菌藥敏試驗結果

3 討論

本試驗首先對送檢的病死豬肺臟組織樣本進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬瘟病毒、豬肺炎支原體檢測，發(fā)現(xiàn)均為陰性。然后經(jīng)細菌分離純化，從送檢樣品中分離到2 株細菌，根據(jù)培養(yǎng)特性、生化試驗和16S rDNA 基因測序結果，鑒定為支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌，從而確診此豬場發(fā)生了支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染。

支氣管敗血波氏桿菌感染可由多因素導致，包括由其他細菌或病毒導致的繼發(fā)感染或混合感染，或由外界應激因素導致，例如畜禽長途運輸、飼養(yǎng)密度過高等[10]。支氣管敗血波氏桿菌的先期感染也易導致其他多種病原的繼發(fā)感染，從而增加豬群呼吸道疾病的嚴重程度?；撾[秘桿菌是一種共生菌，是動物上呼吸道、泌尿生殖道及皮膚黏膜微生物群的一部分，也可在健康牛瘤胃、豬胃及健康奶牛乳房中分離得到[11-12]，作為一種機會致病菌，常與其他病原體共同感染導致宿主發(fā)病[13]。近年來，國內(nèi)不斷有從豬呼吸道疾病中分離出化膿隱秘桿菌的報道[14-18]。但是，在豬呼吸道疾病中卻沒有支氣管敗血波氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染報道。本研究在國內(nèi)首次報道這兩種細菌在豬體內(nèi)的混合感染，對今后豬場疫病的診斷和防治具有較好的參考價值。

本研究通過藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)篩選出的兩株菌對卡那霉素、慶大霉素和頭孢哌酮高度敏感。支氣管敗血波氏桿菌對氨芐西林和克林霉素產(chǎn)生了較強的耐藥性，化膿隱秘桿菌對四環(huán)素、多黏菌素B、紅霉素和克林霉素產(chǎn)生了較強的耐藥性，表明臨床中可能存在抗生素使用不當情況，需要加以控制。本試驗提示，豬場在臨床用藥時，應盡可能輪換用藥，聯(lián)合用藥，按劑量用藥，以避免產(chǎn)生耐藥菌株。同時，應依據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告》附件“食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單”，進一步規(guī)范養(yǎng)殖用藥行為，保障動物源性食品安全。