◎ 龍 慧，帥淑芬，龍永艷，王 偉，吳 葵，鐘 淙

（南昌市疾病預防控制中心，江西 南昌 330038）

近年來，桶裝水安全備受關注，全國各地區(qū)針對桶裝水衛(wèi)生狀況進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)多處不合格。2014—2015年湖北省對桶裝飲用水微生物污染情況進行分析，結果顯示209批次桶裝飲用水總合格率僅為54.07%，其中菌落總數(shù)不合格率為44.50%、大腸菌群不合格率為8.61%[1]；2016—2017年海南省調研了桶裝飲用水微生物污染情況，結果顯示2016年桶裝純凈水的不合格率為10.8%、2017年桶裝純凈水的不合格率為12.9%，且銅綠假單胞菌和大腸菌群為主要污染源[2]；2019年廣西欽州市對桶裝飲用水銅綠假單胞菌污染狀況進行監(jiān)測，結果顯示銅綠假單胞菌檢出率為26.4%[3]。桶裝飲用水是人們生活中的必需品，加強衛(wèi)生監(jiān)督，保障公眾健康，監(jiān)測桶裝水的微生物安全勢在必行。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli）作為最有效的糞便指示菌，能夠直接預測桶裝水是否受到糞便污染[4-5]；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）又稱綠膿桿菌，是社區(qū)水源性疾病感染的重要源頭[6-8]。根據(jù)相關研究報道，人類外露組織接觸或者誤吞食受到大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌污染的桶裝水，容易引起腹瀉、腹部絞痛、眼角膜炎、組織炎癥等疾病[9-11]。因此建立快速、有效的檢測方法對于監(jiān)測桶裝水中大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌污染具有重要意義。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種核酸信號放大技術[12]，通過特異性的引物，在聚合酶的催化下能夠在短時間內實現(xiàn)信號放大。普通PCR技術需要對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，而新型熒光定量PCR技術通過熒光探針，能夠實現(xiàn)實時熒光定量檢測[13]。本研究根據(jù)uidA[14]和gyrB[15]基因設計引物和探針，建立多重熒光定量PCR體系，能夠在一個反應管中實現(xiàn)同時檢測大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌，該方法的建立能夠在一定程度上彌補傳統(tǒng)檢測方法的缺陷，加快桶裝水微生物安全建設。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株信息

本研究使用的菌株包含銅綠假單胞菌CMCC 10104、銅綠假單胞菌ATCC 9027、大腸桿菌ATCC 25922、腸致病性大腸桿菌CICC 10664、產腸毒素性大腸桿菌CICC 10667、出血性大腸桿菌CICC 21530、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、金黃色葡萄球菌CMCC 26003、弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864、奇異變形桿菌CMCC 49005、腸炎沙門氏菌CICC 21482、單核細胞增生李斯特菌ATCC 19115、糞產堿桿菌CMCC 40001、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC 52204，以及實驗室分離株產志賀毒素大腸桿菌。

1.1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液（北京路橋有限公司）、腦心浸出液和營養(yǎng)瓊脂（北京路橋有限公司）、Premix Ex Taq?（寶日醫(yī)生物技術北京有限公司）。

1.1.3 儀器和設備

恒溫水浴鍋（上海智誠分析儀器制造有限公司）；高速離心機（賽默飛世爾）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（Bio-Rad）。

1.1.4 引物和探針設計

選取uidA和gyrB基因為靶標，利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲取uidA和gyrB基因序列，使用Beacon designer 8軟件設計引物和探針，并將設計的序列輸入NCBI BLAST進行特異性驗證，所有序列均委托通用生物公司（北京）合成。uidA基因：上游引物TGGACAT ACCAACCGTAA，下游引物CTGTGTCAATGTAATG TTCTG，探針FAM-CGGTTCAGGCACAGCACATCBHQ1，擴增子長度為96 bp；gyrB基因：上游引物GA CAGCTTCAACGAGAAC，下游引物CGATGTAGTT GTTCAGGTTA，探針Texas Red-TGCTCTGCTTCAC CAACAACATC-BHQ2，擴增子長度為115 bp。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和基因組DNA提取

取瓷珠保存的E. coli和P. aeruginosa接種在腦心浸出液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜進行復蘇，然后通過平板劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平皿上獲取單菌落，最后挑取單菌落接種在腦心浸出液中獲取菌懸液。取E. coli和P. aeruginosa菌懸液各1 mL加入離心管中，于1.5 mL滅菌的離心管中，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，然后加入1 mL超純水重懸，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，重復操作一次，最后重懸在200 μL超純水中。準備100 ℃沸水，將制備好的菌懸液放入其中煮沸15 min，然后放在冰水浴中5 min，最后在12 000 r·min-1離心3 min，取上清液，為細菌基因組DNA，儲存在-20 ℃待用。

1.2.2 退火溫度的優(yōu)化

設置qPCR反應程序的退火溫度為53.0～63.0 ℃，進行熒光梯度PCR。根據(jù)不同退火溫度對應的擴增曲線，比較各溫度對應的相對熒光單位（RFU），確定最佳的退火溫度。

1.2.3 多重熒光定量PCR的擴增

二重熒光定量PCR擴增體系為25 μL，詳細組成：2×Premix Ex Taq? 12.5 μL、10 μmol·L-1的uidA、gyrB上下游引物、探針各0.5 μL、基因組DNA各3 μL、超純水補充至25 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s、55 ℃退火延伸30 s、40個循環(huán)，熒光信號收集在退火和延伸階段。

1.2.4 多重檢測限

將37 ℃過夜培養(yǎng)的菌株取1 mL提取基因組DNA（提取方法參考1.2.1），使用10倍梯度稀釋基因組DNA，然后通過多重熒光定量PCR體系進行擴增，根據(jù)擴增結果構建標準曲線，并確認檢測靈敏度。

1.2.5 方法特異性評價

將表1菌株按照1.2.1菌株培養(yǎng)和基因組DNA提取方法，以各菌株基因組DNA為實驗樣本、目的菌株為陽性樣本、超純水為陰性樣本，按照多重熒光定量PCR體系進行擴增，根據(jù)擴增曲線確認方法特異性。

1.2.6 方法重復性評價

將 濃 度 分 別 為104CFU·mL-1、106CFU·mL-1、108CFU·mL-1的E. coli和P. aeruginosa提取基因組DNA用于多重熒光定量PCR，通過計算變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）評價該方法的組間重復性。

1.2.7 回收率評價

準備菌濃度分別為104CFU·mL-1、106CFU·mL-1、108CFU·mL-1的E. coli和P. aeruginosa各兩組，其中一組通過平板計算得到細菌濃度，另一組提取基因組DNA用于多重熒光定量PCR擴增，將擴增獲取的Ct值代入標準曲線得到細菌濃度，并與實際值進行比較確定方法的回收率。

1.2.8 加標檢測

收集桶裝水50 mL，并通過高壓蒸汽滅菌去除原有細菌用于制備加標樣。取8 mL處理后的桶裝水，分別加入1 mL菌濃度為109CFU·mL-1的E. coli和P. aeruginosa，得到人工加標樣品。通過水煮法提取加標樣中的E. coli和P. aeruginosa基因組DNA，然后利用10倍梯度稀釋基因組DNA進行多重熒光定量PCR，根據(jù)擴增結果構建標準曲線，并確認檢測靈敏度。

2 結果與分析

2.1 退火溫度的優(yōu)化

熒光定量PCR反應體系的退火溫度是影響擴增效果和特異性的重要因素，本研究根據(jù)引物和探針的Tm值設置退火溫度為53.0～63.0 ℃，優(yōu)化結果見圖1。相對熒光單位（RFU）表示在一定循環(huán)數(shù)對應的熒光信號強度，RFU值越大，表示退火溫度越合適。根據(jù)這個原則，最終確定多重熒光定量PCR的退火溫度為55.0 ℃。

2.2 多重熒光定量PCR體系建立

多重熒光定量PCR同時檢測的E. coli和P. aeruginosa結果見圖2。uidA基因擴增曲線為典型的S型曲線，基線平緩、指數(shù)期明顯、無任何分叉，gyrB基因的擴增曲線結果與uidA基因擴增曲線基本相同，且整個qPCR檢測過程在2.0 h內完成，表明多重熒光定量PCR體系成功建立，能夠同時、快速的在一個反應體系檢測兩種目標菌。

圖2 多重熒光定量PCR體系的構建圖

2.3 靈敏度評價

E. coli和P. aeruginosa基因組DNA經(jīng)過10倍梯度，在最優(yōu)條件下按照1.2.3步驟進行PCR擴增，以Ct值為縱坐標，菌株濃度為橫坐標，繪制標準曲線（結果見圖3），得到線性方程：E. coli，y=-3.144x+43.42，擴增效率E=108%，線性相關性R2=0.999 7，檢測限為3.8×102CFU·mL-1；P. aeruginosa，y=-3.227x+44 368，擴增效率E=104%，線性相關性R2=0.999 1，檢測限為2.1×102CFU·mL-1。結果表明E. coli和P. aeruginosa在102～109CFU·mL-1具有良好的擴增效率和線性相關性，而且檢測靈敏度高。

圖3 純菌液中檢測限的確定圖

2.4 特異性評價

多重熒光定量PCR特異性驗證結果如表1所示，2株P. aeruginosa中均檢測出gyrB基因，5株E. coli均檢測出uidA基因，而其他非P. aeruginosa和E. coli菌株均未檢出uidA和gyrB。因此，本研究建立的多重熒光定量PCR具有較高的特異性，可用于同時準確的檢測E. coli和P. aeruginosa。

表1 菌株信息表

2.5 重復性評價

根據(jù)多重熒光定量PCR重復性評價結果統(tǒng)計分析可知，組內變異系數(shù)CV值在0.58%～2.34%，均小于5%，說明本研究建立的多重熒光定量PCR具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 回收率評價

多重熒光定量PCR檢測目標菌回收率計算結果顯示，108CFU·mL-1的E. coli回收率為85.02%、106CFU·mL-1的 回 收 率 為77.54%、104CFU·mL-1為58.82%，108CFU·mL-1的P. aeruginosa回 收 率 為85.48%、106CFU·mL-1的回收 率 為74.45%、104CFU·mL-1為66.17%。

2.7 加標檢測效果

多重熒光定量PCR檢測桶裝水加標樣結果見圖4。以Ct值為縱坐標、菌濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程：E. coli，y=-2.858x+47.61，擴增效率E=108%，線性相關性R2=0.997 0，檢測限為1.48×102CFU·mL-1；P. aeruginosa，y=-3.109x+43.31，擴增效率E=109%，線性相關性R2=0.996 1，檢測限為1.35×103CFU·mL-1。結果表明該方法用于人工加標樣檢測在102～108CFU·mL-1具有較好線性相關性，而且檢測靈敏度較高，具有較高的實際應用價值。

圖4 桶裝水加標檢測限的確定圖

3 結論與討論

本研究以uidA和gyrB為目標基因設計引物和探針，優(yōu)化退火溫度，建立多重檢測體系，在最優(yōu)反應條件下擴增102～109CFU·mL-1目標菌株并繪制標準曲線，成功建立了E. coli和P. aeruginosa多重熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測性能優(yōu)越，通過設計多重引物和探針，在理論設計和實際檢驗均符合多重檢測需求，能夠實現(xiàn)同時對E. coli和P. aeruginosa進行檢測；從核酸提取到PCR擴增結束，僅需要2.0 h就能完成，可以實現(xiàn)快速檢測，能夠滿足大批量篩查的要求；方法檢測靈敏度高，E. coli和P. aeruginosa的檢測限均為102CFU·mL-1，相比于GOLPAYEGANI[16]和DINU[17]等采用同樣的方法檢測靈敏度有所提高，分析原因可能是本研究設計的引物和探針擴增效率更高，反應體系合理能夠大限度的提高檢測靈敏度；方法重復性好，組內設置16個平行、3種不同濃度的目標細菌基因組DNA，變異系數(shù)在0.58%～2.34%，均小于5%，說明該方法擴增性能穩(wěn)定、再現(xiàn)性好。方法特異性良好，對于常見的非目標致病菌均無陽性擴增信號，對于復雜的桶裝水中E. coli和P. aeruginosa的準確檢測提供了必要條件。方法具有較高的回收率，分 別 對104CFU·mL-1、106CFU·mL-1、108CFU·mL-1兩種目標菌進行檢測，比較計算值和平板計數(shù)真值，確定回收率在58.82%～85.48%，低濃度目標菌的回收率低可能造成的原因是10倍梯度稀釋存在一定的誤差，導致回收率偏低。通過對桶裝水加標檢測結果顯示，E. coli的檢測靈敏度為103CFU·mL-1，P. aeruginosa的檢測靈敏度為102CFU·mL-1，擴增效率也存在一定程度的降低，分析原因可能是桶裝水存在一定的干擾物質，且使用簡單的水煮法無法去除，導致靈敏度和擴增效率有所降低。綜合檢測性能評價結果，該方法快速、靈敏度高、特異性強、重復性好，對桶裝水中E. coli和P. aeruginosa能夠實現(xiàn)同時檢測。