王蓓蓓，陳競男，于元大，胡紫騰，畢艷蘭

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，鄭州 450001； 2.裕龍集團有限公司，山東 青島 266000； 3.橡膠谷集團有限公司，山東 青島 266000)

羊毛脂是羊皮脂腺的油狀分泌物，外觀為黃色半透明的軟膏狀半固體，黏性較大，且有微弱、奇特的臭味，熔點為38.42℃，是熔點最低的固體蠟。羊毛脂稍溶于石油醚、丙酮、CCl4等溶劑，難溶于冷乙醇，不溶于水，但在空氣中能吸收自身質(zhì)量2倍的水[1]，具有很好的滲透性，可滲入皮膚，故可用作純天然的化妝品原料[2]。

羊毛脂與一般動植物油脂不同，主要是由多種羥基脂肪酸、脂肪酸與大致等量的脂肪醇、膽甾醇等所形成的酯(約95%)和少量游離酸、游離醇以及烷烴所組成[3]。羊毛醇和羊毛酸作為羊毛脂衍生物中最重要的產(chǎn)品，被廣泛應用于化妝品中。羊毛醇的成分復雜，其中膽甾醇和羊毛甾醇的含量最高，膽甾醇在化妝品、醫(yī)藥、液晶材料方面具有廣泛應用[4-6]。羊毛脂中還含有豐富的支鏈脂肪酸(BCFA)，包含了胎脂中大部分種類的BCFA[7]。羊毛脂在用于化妝品時，其理化指標和主要成分均會對其使用性能造成影響，而現(xiàn)有研究缺少對羊毛脂理化指標及其主要成分的系統(tǒng)分析，因此本研究以羊毛脂為原料，對羊毛脂的主要理化指標及主要組分分別進行檢測及分離，通過一價堿醇溶液及鈣皂轉(zhuǎn)化法對羊毛脂進行皂化及皂化產(chǎn)物分離，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀對所制備的羊毛醇和羊毛酸的組成進行分析，為羊毛脂在化妝品行業(yè)的應用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羊毛脂，青島裕龍東雍國際物流有限公司；膽甾醇、羊毛甾醇標準品，上海源葉生物科技有限公司；十七烷酸甲酯，阿拉丁試劑有限公司；大豆甾醇(純度95%)，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司；大豆甾醇油酸酯(純度>95%)，實驗室自制；大豆油，益海嘉里食品工業(yè)有限公司；正己烷(色譜純)，美國Fisher公司；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，阿拉丁試劑有限公司；正己烷、吡啶、氫氧化鉀，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醚、鹽酸、三氯甲烷，洛陽市化學試劑廠；冰乙酸、無水乙醇，天津市凱通化學試劑有限公司。

電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；頂置式攪拌器，大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；IKA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾倫儀器設備有限公司；7890A氣相色譜儀(GC)、7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)，安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊毛脂主要理化指標的分析

熔點測定，參考GB/T 12766—2008；水分及揮發(fā)物含量測定，參考GB 5009.236—2016；灰分含量測定，參考GB 5009.4—2016；酸值測定，參考GB 5009.229—2016；過氧化值測定，參考GB 5009.227—2016；皂化值測定，參考GB/T 5534—2008；碘值測定，參考GB/T 5532—2008；羥值測定，參考《中國藥典0713》；色度測定，采用Gardner(加德納)比色法，稱取適量羊毛脂于燒杯中，放入(105±2)℃烘箱加熱，使羊毛脂充分熔化，然后快速倒入玻璃管中，與配制好的加德納色標比對。

1.2.2 原料羊毛脂的薄層色譜(TLC)分析

按照參考文獻[8]，選用展開劑正己烷-乙醚-冰乙酸(體積比90∶10∶2)對羊毛脂進行TLC分析。

1.2.3 原料羊毛脂的主要組分含量分析

采用柱層析法對原料羊毛脂進行分離，洗脫條件為：①采用正己烷-乙醚-冰乙酸(體積比80∶20∶2)為洗脫劑，洗脫至游離甾醇全部流出(用TLC分析進行判斷)；②再采用丙酮對剩余大極性組分進行洗脫，至洗脫完全(用TLC分析進行判斷)。

對不同組分進行收集鑒定(用TLC)，分別得到脂肪酸酯、羥基酸酯、游離甾醇與多羥基物殘留物。對各組分分別稱重并計算其含量(以質(zhì)量分數(shù)計)。

1.2.4 羊毛脂中甘油三酯的分析

以大豆油為標準對原料羊毛脂進行TLC分析[7]，以確定甘油三酯譜帶。將羊毛脂的甘油三酯譜帶刮下，采用正己烷萃取，旋蒸后得甘油三酯，加入0.5 mL十七烷酸甲酯(0.799 2 g/100 mL)作為內(nèi)標，氮氣吹干后進行GC分析。

GC條件：DB-1ht色譜柱(28 m×250 μm×0.1 μm)；升溫程序為初溫100℃，保持1 min，以50℃/min升溫至220℃，保持2 min，以15℃/min升溫至290℃，保持2 min，以40℃/min升溫至320℃，保持6 min，再以20℃/min升溫至360℃，保持8 min；進樣量1 μL；進樣口溫度350℃；氫火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度350℃；氮氣流速4 mL/min；氫氣流速40 mL/min；空氣流速300 mL/min。

1.2.5 羊毛脂中羊毛醇的組成及相對含量分析

1.2.5.1 羊毛醇的提取

采用皂化→鈣化→醇分離的方法提取原料羊毛脂中的羊毛醇，其中皂化參照張玨等[9]的方法，鈣化參照陳洋等[10]的方法，醇分離參照沈濤[11]的方法，具體流程如圖1所示。

圖1 羊毛脂中羊毛醇的提取工藝流程

1.2.5.2 羊毛醇組成及相對含量分析

取0.1 g羊毛醇粗提物，加入硅烷化試劑(200 μL BSTFA試劑+200 μL吡啶)，于65℃水浴中反應1.5 h以進行硅烷化處理，然后用氮氣吹干，再加入正己烷溶解，過濾膜后進行GC-MS分析。GC條件：HP-5色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；載氣為氮氣，流速1.0 mL/min；柱溫285℃，保持20 min；進樣口溫度300℃；FID檢測器溫度360℃；分流比20∶1；進樣量1 μL。MS條件：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電離電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～650 u。

根據(jù)計算機譜庫匹配和人工解析各組分質(zhì)譜圖確定各保留時間對應的化合物，采用面積歸一化法對化合物進行定量。

1.2.5.3 羊毛脂中膽甾醇和羊毛甾醇含量的測定

采用外標法測定。

膽甾醇標準曲線的建立：準確稱取50.0 mg膽甾醇于試管中，加入硅烷化試劑(400 μL BSTFA試劑+1 000 μL吡啶)，65℃水浴下反應1.5 h進行硅烷化處理，反應結(jié)束后用氮氣吹干。用正己烷溶解于25 mL容量瓶中，并稀釋定容，分別移取5.0、2.5、1.0、0.5 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，得到2 000、1 000、500、200、100 μg/mL不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，通過GC分析建立標準曲線，GC條件同1.2.5.2。

樣品測定：取20 mg羊毛醇粗提物(精確到0.1 mg)于試管中，按1.2.5.2進行硅烷化處理，用氮氣吹干后用正己烷定容于10 mL容量瓶中，過濾膜后進行GC分析，根據(jù)所建立的標準曲線計算羊毛脂中膽甾醇含量，再以膽甾醇含量(作為內(nèi)標物)計算羊毛甾醇的含量。

1.2.6 羊毛脂中羊毛酸的組成及相對含量分析

1.2.6.1 羊毛酸的提取

采用皂化→鈣化→醇洗→酸化、萃取、有機層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的工藝提取羊毛酸，其中：皂化、鈣化同1.2.5.1的方法(皂化時間改為6 h，鈣化溫度改為50℃)；醇洗，酸化、萃取、有機層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)具體操作步驟參考文獻[10]。

1.2.6.2 羊毛酸的組成及相對含量分析

取1～2滴羊毛酸，加入6 mL甲醇-NaOH溶液煮沸，再加入7 mL三氟化硼-乙醚甲醇(體積比1∶4)溶液煮沸3 min，加入2 mL正己烷煮沸1 min，然后加入適量飽和氯化鈉溶液，振蕩后靜置分層，取出上清液加入適量無水Na2SO4，離心過濾膜后進行GC-MS分析。GC條件：HP-5色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；升溫程序為初始溫度120℃，保持0.5 min，以10℃/min升至240℃，保持45 min；進樣口溫度280℃；載氣為N2，流速1.2 mL/min。MS條件：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電離電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～500 u，溶劑延遲2 min。

根據(jù)計算機譜庫匹配和人工解析各組分質(zhì)譜圖確定各保留時間對應的化合物，采用面積歸一化法對化合物進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊毛脂的主要理化指標

對原料羊毛脂的主要理化指標進行了測定，并與文獻[12]中的精制羊毛脂(藥典級)進行了對比，結(jié)果見表1。由表1可見，本文使用的原料羊毛脂的熔點、皂化值與過氧化值符合文獻[12]的精制羊毛脂(藥典級)要求，但其水分及揮發(fā)物含量、灰分含量、酸值與碘值均超過了文獻標準。原料羊毛脂的色度為13，色澤較深。羥值一定程度上反映化合物的親水能力，原料羊毛脂的羥值(KOH)為39.91 mg/g。另外，原料羊毛脂有較重的羊毛味道。

表1 羊毛脂的主要理化指標

2.2 羊毛脂的TLC分析

按1.2.2采用TLC對原料羊毛脂樣品進行組分分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，樣品呈現(xiàn)清晰的7條色帶。參考吳敦漢等[8]的研究可知，脂肪酸甾醇酯、羥基酸甾醇酯、游離甾醇經(jīng)三氯化銻顯色后呈紫色，脂肪酸脂肪醇酯顯土黃色，羥基酸脂肪醇酯顯黃色，游離脂肪醇顯藍色，多羥基物殘留物顯綠色。通過與大豆甾醇油酸酯、大豆甾醇等標準品進行對照后，可判斷圖2中7條色帶由上至下依次為脂肪酸甾醇酯(Rf=0.71)、脂肪酸脂肪醇酯(Rf=0.67)、羥基酸甾醇酯(Rf=0.29)、羥基酸脂肪醇酯(Rf=0.27)、游離脂肪醇(Rf=0.24)、游離甾醇(Rf=0.15)、多羥基物殘留物(游離脂肪酸、多羥基物、色素等)(Rf=0/0.03)。由圖2還可以看出，脂肪酸酯、羥基酸酯、游離甾醇、多羥基物殘留物分離度較好，故可通過柱層析對不同組分進行分離后，再定量分析。

“每一個即將出廠的工件，都要一絲不茍地接受認真檢測，絕不給任何質(zhì)量隱患留下可乘之機。這也是該油田實施‘四化’建設過程中對標準化采購工作的要求?！眲倮吞镂镔Y供應處標準化采購專家、物資供應辦公室主任韓向東說。標準化采購工作開展以來，向高質(zhì)量產(chǎn)品追根溯源，對生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題，多部門出具整改方案，進行分級定性改造，有效規(guī)避了質(zhì)量風險，為油田避免經(jīng)濟損失。

圖2 羊毛脂的TLC圖譜

2.3 羊毛脂的主要組分含量

按1.2.3采用柱層析法對原料羊毛脂進行分離，在上樣量為2.0287 g時，分別得到1.118 6 g脂肪酸酯、0.518 7 g羥基酸酯、0.081 9 g游離甾醇、0.266 8 g多羥基物殘留物，分別占羊毛脂總質(zhì)量的55.14%、25.57%、4.04%和13.15%，其中脂肪酸酯及羥基酸酯的總含量為80.71%。通過對得到的4種組分進行薄層色譜分析可知(以大豆甾醇油酸酯標準品、大豆甾醇標準品作為對照)，4種不同組分均無雜質(zhì)，純度較高，定量準確。

2.4 羊毛脂中甘油三酯的含量

以大豆油為標準對羊毛脂進行TLC分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 羊毛脂和大豆油的TLC圖譜

將圖3中甘油三酯對應的譜帶刮下，萃取后進行氣相色譜分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，大豆油的氣相色譜圖中22.5～28.0 min為甘油三酯的出峰位置，而羊毛脂的氣相色譜圖中只在3.999 min出現(xiàn)十七烷酸甲酯的出峰，而在22.5～28.0 min未有峰檢出，說明羊毛脂中甘油三酯含量未達到檢出限。

2.5 羊毛脂中羊毛醇的組成及含量

2.5.1 羊毛醇的組成及相對含量

由圖5可見，膽甾醇與羊毛甾醇的出峰時間分別為6.791、9.428 min，膽甾醇衍生物的特征離子碎片峰為m/z129、329.3和368.3，羊毛甾醇衍生物的特征離子碎片峰為m/z69.1、393.3[13]。根據(jù)羊毛醇的GC圖譜，計算羊毛醇中各組分的相對含量，結(jié)果如表2所示。

由表2可見，羊毛醇的主要組成為膽甾醇、羊毛甾醇和二氫羊毛甾醇，相對含量分別為44.31%、14.62%和5.74%。

表2 羊毛醇的組成及相對含量

2.5.2 羊毛脂中膽甾醇與羊毛甾醇的含量

由2.5.1中羊毛醇的組成分析可知，膽甾醇和羊毛甾醇是羊毛脂中的主要醇類。因此，對羊毛脂中膽甾醇與羊毛甾醇的絕對含量進行分析。按1.2.5.3方法建立膽甾醇的標準曲線，采用外標法對羊毛脂中的膽甾醇與羊毛甾醇進行定量。經(jīng)分析計算，羊毛脂中膽甾醇與羊毛甾醇的含量分別為10.41%與3.43%。這與沈濤[11]報道的羊毛脂中膽甾醇和羊毛甾醇含量分別為12%與6%略有差異，可能與原料來源不同有關(guān)。

2.6 羊毛脂中羊毛酸的組成及含量

按照1.2.6.1的方法對原料羊毛脂中的羊毛酸進行提取，羊毛酸的得率為28.37%。提取的羊毛酸經(jīng)甲酯化后采用GC-MS進行分析，結(jié)果如圖6和表3所示。

圖6 羊毛酸的GC-MS圖譜

表3 羊毛酸的脂肪酸組成及相對含量

由表3可知，羊毛酸中主要為飽和脂肪酸，碳鏈長度為C13～C27，其中支鏈脂肪酸的相對含量高達62.03%，異構(gòu)支鏈脂肪酸的相對含量為27.56%，反異構(gòu)支鏈脂肪酸的相對含量為34.47%。這與陳洋等[10]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

與精制羊毛脂(藥典級)相比，本研究的原料羊毛脂色澤較深，水分及揮發(fā)物含量、灰分含量、碘值與酸值略高。羊毛脂的主要組成成分為脂肪酸酯、羥基酸酯、游離甾醇及多羥基物殘留物，分別占羊毛脂總質(zhì)量的55.14%、25.57%、4.04%和13.15%。羊毛脂中甘油三酯未檢出。羊毛脂中羊毛醇的主要組成為膽甾醇與羊毛甾醇，相對含量分別為44.31%、14.62%，膽甾醇和羊毛甾醇在羊毛脂中的含量分別為10.41%、3.43%。羊毛脂中羊毛酸的主要組成為飽和脂肪酸，碳鏈長度為C13～C27，其中支鏈脂肪酸的相對含量高達62.03%，異構(gòu)支鏈脂肪酸的相對含量為27.56%，反異構(gòu)支鏈脂肪酸的相對含量為34.47%。