馬文斌,王 萌,潘陽(yáng)陽(yáng),王靖雷,張燕燕,高麗青,張 暉,王軍乾,余四九,王立斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2，ENPP2)又稱自分泌趨化因子(autotaxin，ATX)[1]。它由2個(gè)N-末端生長(zhǎng)激素B樣結(jié)構(gòu)域(SMB1和SMB2)、1個(gè)中心催化磷酸二酯酶(PDE)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C-末端核酸酶樣結(jié)構(gòu)域(NUC)組成[2]，是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases，ENPPs)家族中的1種，該家族中只有ENPP2具有溶血磷脂酶D(lysoPLD)活性，能以溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)為底物催化生成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)[3]。LPA是一種胞外信號(hào)分子，其通過與6種不同的G蛋白偶聯(lián)受體(LPA1-6)結(jié)合發(fā)出信號(hào)，這些受體存在于許多不同類型的細(xì)胞表面，連接多個(gè)下游信號(hào)通路[3]。在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，如參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等許多生理和病理的過程[4]。ENPP2最早是從人黑色素細(xì)胞中分離得到的[5]，目前已經(jīng)證實(shí)Enpp2基因在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，比如在腦、胎盤和卵巢中都能檢測(cè)其mRNA的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，敲除Enpp2基因后，小鼠在胚胎發(fā)育的第9.5天死亡，并證實(shí)其在卵黃囊血管形成中發(fā)揮重要作用。Ahn H J等[7]檢測(cè)了大鼠子宮中ENPP2的表達(dá)，結(jié)果顯示在不同發(fā)情周期ENPP2的表達(dá)量不同；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在小鼠子宮中ENPP2的表達(dá)受到雌激素的調(diào)控。Seo H等[8]發(fā)現(xiàn)在豬發(fā)情周期和妊娠期所有階段的子宮內(nèi)膜中均檢測(cè)到ENPP2的表達(dá)，并證明ENPP2可能調(diào)節(jié)LPA的合成，在豬妊娠過程中的建立中發(fā)揮著重要作用。Sinderewicz E等[9]研究證明ENPP2在牛卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高海拔的一種特有畜種，對(duì)牧區(qū)人們的生活起著非常重要的作用，其低繁育率的問題大大地影響了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展，也一直以來受到人們的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于ENPP2在牦牛生殖器官中表達(dá)和定位的報(bào)道。為了探明ENPP2對(duì)牦牛生殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用，本研究擬克隆Enpp2基因，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ENPP2在牦牛不同繁殖階段卵巢、輸卵管和子宮中的表達(dá)與定位，為進(jìn)一步探究ENPP2在調(diào)節(jié)牦牛生殖生理活動(dòng)中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 樣品采集 選取健康雌性牦牛，年齡4歲～8歲，處于卵泡期(卵巢上有優(yōu)勢(shì)卵泡)、黃體期(卵巢上有明顯黃體)和妊娠期的牦牛各3頭，頸動(dòng)脈放血處死后，采集卵巢、輸卵管和子宮樣品。一部分用錫箔包住后放入-196 ℃液氮中保存，用于RT-qPCR、Western blot和基因克隆試驗(yàn)；另一部分放入含40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組化試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 提取牦牛卵巢、輸卵管和子宮的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 在GenBank上參考基因序列，牛(Bostaurus)登錄號(hào)：NM-001080293.1，設(shè)計(jì)引物。引物序列、退火溫度和產(chǎn)物長(zhǎng)度等見表1。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 基因克隆 PCR的反應(yīng)體系為：Taq酶10 μL，模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，62.3 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(擴(kuò)增)，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物回收DNA序列，與 pMDTM19-TVector載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，加入SOC培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min恒溫振蕩1 h，取120 μL涂于含有Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆菌放入有Amp的液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜，將菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析牦牛Enpp2基因同源性；利用MEGA7.0軟件鄰域聯(lián)結(jié)法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用NCBI在線軟件Open reading frame finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)進(jìn)行開放閱讀框分析；利用在線軟件ExPASy Protparam (https://web.expasy.org/protparam)分析理化性質(zhì)；利用PSIPRED在線軟件(http:bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預(yù)測(cè)ENPP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.ex-pasy.org)預(yù)測(cè)ENPP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線軟件Prots Cale (https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白親疏水性；利用在線軟件TMHMMServerV2.0 (http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域；利用在線軟件Netphos預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)。

1.2.6 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表達(dá)

1.2.6.1 總蛋白的提取及變性 低溫研磨組織后加入蛋白裂解液，待組織充分裂解后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液與上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，100 ℃變性10 min，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的表達(dá) 使用60 g/L的分離膠和120 g/L的濃縮膠，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，切出目的條帶(115 ku)和內(nèi)參條帶(42 ku)，用0.45 mm PDVF膜轉(zhuǎn)膜，PBST溶液沖洗，50 mg/mL脫脂奶粉4 ℃封閉8h，PBST沖洗。一抗(1∶500)孵育，4 ℃過夜，PBST溶液洗3次，每次10 min：二抗(1∶1 000)搖床37 ℃孵育60 min，PBST溶液沖洗6次，每次10 min。在PDVF膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，避光1 min，在發(fā)光儀下掃描PDVF膜，ImageJ分析圖像，根據(jù)灰度值分析ENPP2的表達(dá)量。

1.2.7 ENPP2在牦牛生殖器官中的定位 制作牦牛生殖器官組織切片，烘片6 h，脫蠟，在檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復(fù)；滴加30 mL/L的過氧化氫溶液，37 ℃孵育 10 min，PBS溶液洗3次每次3 min；滴加封閉液(A液)，37 ℃孵育15 min，滴加一抗 (1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜，陰性對(duì)照加 PBS替代一抗，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加二抗(B 液)，37 ℃孵育15 min，PBS溶液洗3次，每次3 min；滴加C液，37 ℃孵育 15 min；加DAB顯色液避光顯色；復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡(DP71，日本Olympus) 拍照。

2 結(jié)果

2.1 牦牛 Enpp2 基因克隆

牦牛Enpp2基因的擴(kuò)增條帶見圖1，連接載體測(cè)序后與參考序列(NM-001080293.1)相似度為99%。測(cè)序結(jié)果已提交至NCBI GenBank，基因登錄號(hào)為MW030285。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.卵巢；2.輸卵管；3.子宮

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1Enpp2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 在NCBI Blast比對(duì)同源性結(jié)果顯示，牦牛(Bosgrunniens)MW030285與牛 (Bostaurus) NM-001080293.1、水牛 (Bubalusbubalis) XM-006074703.2、綿羊(Ovisaries) XM-004011866.4、白鰭豚 (Lipotesvexillifer) XM-007451670.1、駱駝 (Camelusdromedarius) XM-031439546.1、馬(Equuscaballus) XM-003365623.4、澳洲野犬(Canislupusdingo) XM-035718429.1和狐獴 (Suricatasuricatta) XM-029923366.1的同源性分別為99.03%、97.90%、96.41%、91.86%、90.98%、90.36%、90.03%和89.95% 。使用軟件MEGA 7.0 構(gòu)建牦牛Enpp2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。

圖2 牦牛Enpp2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(★表示本試驗(yàn)克隆)

2.2.2Enpp2開放閱讀框分析及基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 經(jīng)NCBI在線軟件ORF finder分析表明，Enpp2基因ORF全長(zhǎng)2 669 bp，總共編碼875個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為100 093.77 u，分子式為C4 469H6 832N1 224O1 301S49，理論等電點(diǎn)為是7.14，含20種氨基酸，亮氨酸含量最多(8%)，色氨酸含量最少(1.4%)。帶負(fù)電荷殘基總數(shù)108個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)107個(gè)。該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為56.80，為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3Enpp2基因編碼蛋白的信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)域分析 根據(jù)在線軟件Prots Cale預(yù)測(cè)Enpp2基因編碼蛋白疏水性結(jié)果表明，位于16位的苯丙氨酸疏水性最強(qiáng)，位于827位的天冬氨酸親水性最強(qiáng)；結(jié)果顯示該蛋白氨基酸親水性大于疏水性，為可溶性蛋白。根據(jù)在線軟件SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)Enpp2編碼蛋白信號(hào)肽，證明該蛋白有信號(hào)肽，信號(hào)肽含量為69.67%。TMHMM Server V 2.0 軟件分析顯示牦牛ENPP2蛋白有跨膜螺旋，為跨膜蛋白。利用在線軟件Netphos預(yù)測(cè)ENPP2蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，有38個(gè)絲氨酸、28個(gè)蘇氨酸和 12個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)大于閾值0.5，可以稱為蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點(diǎn)，總共78個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.2.4Enpp2基因編碼的蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由在線軟件PSIPRED預(yù)測(cè)牦牛ENPP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示。在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)ENPP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 牦牛Enpp2基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4 牦牛Enpp2基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 Enpp2基因在牦牛生殖器官中的表達(dá)

Enpp2基因在牦牛生殖器官中均有表達(dá)(圖5)。在卵巢中，妊娠期Enpp2基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于卵泡期和黃體期；在輸卵管中，其相對(duì)表達(dá)量在黃體期最高，卵泡期次之，妊娠期最低；在子宮中，妊娠期的相對(duì)表達(dá)量有明顯低于卵泡期和黃體期。

A.卵巢；B.輸卵管;C.子宮;不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;Different lowercase letters mean significant difference，P<0.05

2.4 ENPP2蛋白的表達(dá)

ENPP2在牦牛卵巢、輸卵管和子宮中均有表達(dá)(圖6)。在卵巢中，妊娠期ENPP2的相對(duì)表達(dá)量明顯高于卵泡期和黃體期；在輸卵管中，各時(shí)期ENPP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量有顯著差異，從高到低依次為黃體期、妊娠期和卵泡期；在子宮中，妊娠期ENPP2的相對(duì)表達(dá)量明顯低于卵泡期和黃體期。

A.卵巢；B.輸卵管;C.子宮;1、2、3分別表示卵泡期、黃體期、妊娠期;不同的小寫字母代表ENPP2蛋白表達(dá)差異顯著，P<0.05A.Ovary；B.Oviduct；C.Uterus;1，2，and 3 indicate follicular phase，luteal phase，and pregnancy;Different lowercase letters mean significant differences in ENPP2 protein expressions，P<0.05

2.5 ENPP2蛋白在牦牛生殖器官中的定位

ENPP2蛋白在母牦牛卵巢、輸卵管和子宮中均有陽(yáng)性表達(dá)(圖7)，在卵巢中，妊娠期和黃體期ENPP2主要表達(dá)在黃體細(xì)胞(CL)，卵泡期主要表達(dá)在卵泡膜(TF)和卵泡顆粒層(SG)；輸卵管中，各時(shí)期表達(dá)無顯著差異，其主要表達(dá)在黏膜上皮(EM)；子宮中，各時(shí)期表達(dá)無顯著差異，主要表達(dá)在子宮腺(UG)和子宮內(nèi)膜(EP)。

A～I(xiàn)為免疫組織化學(xué)染色;其中 A-F為陽(yáng)性表達(dá);G、H、I為陰性對(duì)照；A、D為卵巢；B、E為輸卵管；C、F為子宮。EM.黏膜上皮；SG.顆粒層；TF.卵泡膜；CL.黃體細(xì)胞；EP.子宮內(nèi)膜； UG.子宮腺；A、B、C、D、E、F中右上角為黑色區(qū)域高倍圖

3 討論

本研究成功克隆出了牦牛Enpp2基因，總長(zhǎng)度為2 669 bp，共編碼875個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果為牦牛Enpp2基因與牛的相似度最高(99%)，與狐獴的相似度最低(89%)。Enpp2基因在進(jìn)化過程中具有與高度保守性，且在種屬之間存在差異性。生物信息學(xué)推測(cè)結(jié)果表明Enpp2基因編碼的蛋白質(zhì)有信號(hào)肽，Jansen S[10]研究發(fā)現(xiàn)ENPP2的N-末端疏水基是信號(hào)肽，這與本試驗(yàn)推測(cè)的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明ENPP2蛋白是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白。研究表明溶血磷脂酶D(lysoPLD)是ENPP2的可溶性形式[11]，與本試驗(yàn)推測(cè)結(jié)果相一致。牦牛Enpp2基因與?；蛳嗨贫茸罡?，Enpp2基因編碼的蛋白有信號(hào)肽，是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白。

本試驗(yàn)研究表明,ENPP2在卵巢妊娠期相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期和黃體期，ENPP2在各時(shí)期卵巢黃體細(xì)胞中有表達(dá)。說明ENPP2參與牦牛妊娠的維持。在妊娠期孕酮激素分泌增加，因此ENPP2的表達(dá)很可能受到孕酮的正向調(diào)節(jié)。ENPP2表達(dá)定位于牦牛卵巢的卵泡膜和顆粒細(xì)胞中，卵泡膜作為卵泡的重要組成部分，在卵泡發(fā)生發(fā)育發(fā)揮著重要作用。Sinderewicz E等[12]和Boruszewska D等[13]研究表明ENPP2在牛卵泡的發(fā)生發(fā)育過程中起作用。綜上推斷ENPP2可能參與牦牛妊娠的維持和卵泡的發(fā)育。

ENPP2在不同繁殖階段牦牛輸卵管中普遍表達(dá)，與前人研究其在黃牛輸卵管中的表達(dá)結(jié)果一致[13]。ENPP2在牦牛黃體期輸卵管中表達(dá)最高，妊娠期次之，卵泡期最低。在卵泡期，隨著卵泡發(fā)育，雌激素的合成與分泌逐漸增加，而孕激素在相對(duì)較低的水平，輸卵管黏膜上皮持續(xù)生長(zhǎng)、增殖，有少量分泌細(xì)胞；在黃體期，伴隨黃體的形成，雌激素的分泌下降，而孕激素水平顯著上升，此時(shí)輸卵管黏膜上皮纖毛細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)去纖毛化現(xiàn)象，分泌細(xì)胞明顯增多，為運(yùn)輸卵子做準(zhǔn)備[14]。ENPP2在牦牛輸卵管中的表達(dá)部位為黏膜上皮，輸卵管黏膜上皮主要由纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成。Sinderewicz E等[9]研究表明由ENPP2促進(jìn)生成的LPA可能參與配子的轉(zhuǎn)運(yùn)、受精和輸卵管與卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體之間的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。綜上所述，ENPP2可能通過LPA參與卵子的運(yùn)輸、受精并與早期妊娠有關(guān)，且ENPP2可能受到孕酮激素的正向調(diào)節(jié)。

子宮是動(dòng)物孕育胎兒的場(chǎng)所。子宮內(nèi)膜是子宮中孕育胎兒的重要結(jié)構(gòu)，其具有分泌功能，子宮腺是子宮中的分泌腺，其對(duì)胎兒的發(fā)育非常關(guān)鍵。免疫組化結(jié)果顯示，妊娠期ENPP2表達(dá)定位于牦牛的子宮內(nèi)膜及子宮腺中。因此，ENPP2可能在胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ENPP2在綿羊和豬子宮中均有表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)ENPP2在牦牛子宮中，卵泡期和黃體期表達(dá)顯著高于妊娠期，與豬[9]子宮中的表達(dá)規(guī)律基本一致。Seo H等[8]和Boruszewska D等[15]研究ENPP2促進(jìn)產(chǎn)生的LPA可能在豬及牛胚胎的著床和妊娠的建立中起關(guān)鍵作用，因此，ENPP2可能參與妊娠的建立及胎兒的發(fā)育。

本研究成功克隆牦牛Enpp2基因，登錄號(hào)為MW030285；其ORF全長(zhǎng)為2 669 bp，共編碼875個(gè)氨基酸，此基因表現(xiàn)為高度保守且種屬之間存在顯著差異；ENPP2蛋白是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白，具有信號(hào)肽。ENPP2在牦牛不同繁殖階段的生殖器官中均有表達(dá)且表達(dá)存在差異性。ENPP2蛋白定位在卵泡膜、卵泡顆粒層、黃體細(xì)胞、輸卵管的生殖上皮、子宮腺、子宮內(nèi)膜。本研究結(jié)果提示ENPP2可能參與卵子的發(fā)生發(fā)育、運(yùn)輸以及維持妊娠和胎兒的發(fā)育。