沈佳聰， 李小鵬， 程曉宇， 車媛梅， 雷 彎， 周觀林， 張倫理

1 浙江省紹興市人民醫(yī)院 感染科， 浙江 紹興 312000； 2 南昌大學第一附屬醫(yī)院 感染性疾病診療中心，江西省肝細胞再生醫(yī)學重點實驗室， 南昌 330006； 3 南昌大學第一附屬醫(yī)院 科技處， 南昌 330006；4 江西省贛州市第五人民醫(yī)院 肝病科， 江西 贛州 341099

慢加急性肝衰竭(ACLF)是慢性肝病患者的常見終末期肝病。在我國，HBV相關ACLF(HBV-ACLF)患者數(shù)量約占肝衰竭患者總數(shù)的80%以上[1-2]。核苷(酸)類似物(NUC)是臨床常用的乙型肝炎抗病毒治療藥物。通過長期NUC抗病毒治療，可以降低患者發(fā)生肝衰竭、肝硬化或肝細胞癌的風險，從而改善患者的長期預后，延長生存期[3]。隨著NUC在我國廣泛應用，抗病毒治療療程延長，除了部分患者按照指南的建議停藥，更多患者因經(jīng)濟因素、依從性欠佳等原因自行停藥，從而導致肝炎復發(fā)。據(jù)統(tǒng)計[4]，NUC抗病毒治療過程中停藥導致的肝炎復發(fā)率高達35%～80%，復發(fā)病情往往較重，部分進展為HBV-ACLF，危及患者生命[5]。HBeAg作為一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的非結構性病毒蛋白，既可參與調(diào)節(jié)免疫反應，也可維持HBV持續(xù)感染，且與肝損傷程度相關[6]。本研究旨在探討HBeAg陽性與HBeAg陰性慢性乙型肝炎(CHB)患者停用NUC抗病毒治療后致HBV-ACLF的臨床病情轉(zhuǎn)歸的差異及可能的原因，從而為判斷NUC停藥致HBV-ACLF的預后提供一定證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2018年12月于南昌大學第一附屬醫(yī)院收治的停用NUC后致HBV-ACLF的CHB患者。按照HBeAg狀態(tài)分為HBeAg陽性組和HBeAg陰性組。HBV-ACLF診斷標準參考中華醫(yī)學會《肝衰竭診治指南(2018年版)》[2]：在CHB的基礎上，因停用NUC(停藥時所有患者血清HBV DNA均<500 IU/mL)引起的以急性黃疸進行性加深、凝血功能障礙為主要表現(xiàn)的綜合征，可并發(fā)有感染、肝性腦病、腹水、電解質(zhì)紊亂、肝腎綜合征等?；颊唿S疸短時間內(nèi)進行性加深，血清TBil≥10倍正常值上限或每日上升≥17.1 μmol/L；有出血傾向，PTA≤40%(或INR≥1.5)。排除標準：(1)住院資料不完全者；(2)合并因毒物、藥物、遺傳代謝性疾病、自身免疫等其他因素所致肝功能異常；(3)合并其他急性嗜肝或非嗜肝病毒感染；(4)合并肝臟或其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(5)妊娠或哺乳期婦女；(6)合并嚴重循環(huán)、呼吸系統(tǒng)疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 收集記錄患者入院時各項臨床數(shù)據(jù)，包括性別、年齡、臨床表現(xiàn)及體征，TBil、DBil、ALT、AST、PT、活化部分PT(APTT)、PT/INR、HBV DNA定量檢測結果，以及并發(fā)癥(肝性腦病、肝腎綜合征、自發(fā)性腹膜炎等)情況。

1.2.2 病情轉(zhuǎn)歸評估標準 結合患者病情記錄、出院記錄以及出院前復查肝功能結果與之前結果對比趨勢，將病情轉(zhuǎn)歸定義：(1)好轉(zhuǎn)(生存)，即患者臨床癥狀(如乏力、納差、腹脹、出血傾向等)較前緩解，或黃疸、腹水、消化道出血、感染等體征較前減輕或消失，或膽紅素、PTA等實驗室檢查指標較前改善并出院；(2)惡化(死亡)，即患者臨床癥狀(如乏力、納差、腹脹、出血傾向等)持續(xù)不能緩解，或黃疸、腹水、消化道出血、感染等體征加重，或膽紅素、PTA等實驗室檢查指標持續(xù)惡化，患者死亡或患者家屬放棄治療自動出院。

1.2.3 HBV前基因組RNA(HBV pgRNA)檢測 為了探討長期NUC治療后不同HBeAg狀態(tài)患者停藥后肝炎復發(fā)致HBV-ACLF不同預后的原因，選取持續(xù)NUC抗病毒治療>2年且HBV DNA<20 IU/mL的CHB患者，收集并檢測其血清HBV pgRNA水平。HBV pgRNA檢測流程：(1)核酸的提取或純化。采用核酸提取或純化試劑(廣州海力特生物科技有限公司)從血清中提取總RNA。取600 μL樣本中加入872 μL工作液(包括800 μL裂解液+60 μL蛋白酶K+12 μL載體RNA)，56 ℃孵育15 min；然后將所有液體分2次轉(zhuǎn)移至離心柱中，10 000 r/min離心1 min，棄濾液；后向離心柱中加入500 μL洗滌液1，再次10 000 r/min離心1 min，棄濾液；再向離心柱中加入500 μL的洗滌液1，再次10 000 r/min離心1 min，棄濾液；然后向離心柱中加入500 μL的洗滌液2，轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心3 min，棄濾液；再次13 000 r/min離心1 min；然后將離心柱轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，向離心柱膜中央加入60 μL洗脫液；室溫放置1 min后，10 000 r/min離心1 min，丟棄離心柱。該1.5 mL管中收集到的液體即為提取的核酸。(2)HBV pgRNA定量檢測。采用pgRNA檢測試劑盒(廣州海力特生物科技有限公司)進行。首先使用該檢測試劑盒中的酶切體系對提取到的核酸進行處理，向每份提取的核酸中加入1 μL DNaseⅠ和5 μL Buffer D，先37 ℃孵育30 min，后又立即80 ℃孵育2 min。向30 μL反應液中加入20 μL酶切后的核酸(總反應體積為50 μL)，通過SLAN 96P實時熒光定量PCR(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)測定HBV pgRNA水平。程序設置為：45 ℃×45 min，95 ℃×2 min；95 ℃×15 s，66 ℃×15 s，72 ℃×20 s，循環(huán)3次；95 ℃×15 s，63 ℃×15 s，72 ℃×20 s，循環(huán)9次；95 ℃×15 s，60 ℃×45 s(僅在此處采集熒光信號)，循環(huán)40次。該試劑盒標準品為包含重組目的序列的假病毒，通過將信號與標準曲線比較來量化樣本中的HBV pgRNA。試劑盒的最低檢出下限為15 拷貝/mL，定量范圍為5.0×101～1.0×108拷貝/mL。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：(2020)醫(yī)研倫審第(7-189)，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入停用NUC后肝炎復發(fā)致HBV-ACLF的CHB患者108例，其中HBeAg陽性組57例(52.8%)，HBeAg陰性組51例(47.2%)。HBeAg陽性組與HBeAg陰性組在性別、年齡以及是否合并有肝硬化病史方面的差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 病毒學、生化學指標 以500拷貝/mL為界分HBV DNA陰/陽性。HBeAg陽性組入院時HBV DNA水平明顯高于HBeAg陰性組(P=0.002)，ALT、AST、TBil、DBil、PT、APTT、INR指標兩組差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表2)。

2.3 HBeAg狀態(tài)和HBeAg、抗-HBe及抗-HBc水平與病情轉(zhuǎn)歸的關系 以1 COI為界分HBeAg陰/陽性。HBeAg陽性組好轉(zhuǎn)率49.1%，HBeAg陰性組好轉(zhuǎn)率74.5%。生存/好轉(zhuǎn)組入院時HBeAg陰性患者明顯多于死亡/惡化組(P=0.006)；生存/好轉(zhuǎn)組與死亡/惡化組HBeAg、抗-HBe水平、抗-HBc水平差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表3)。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者病毒學、生化學指標比較

2.4 長期NUC治療后HBeAg陽性/陰性組患者HBV pgRNA水平 在48例長期NUC抗病毒治療達到病毒學應答的CHB患者中，HBeAg陽性/陰性組間性別、年齡、HBsAg水平、HBV pgRNA檢出率差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。HBeAg陽性組HBV pgRNA載量明顯高于HBeAg陰性組(P=0.049)(表4)。

3 討論

慢性HBV感染是一個全球性的健康問題，長期慢性感染可引起肝硬化、肝細胞癌和肝病相關死亡等高風險[7-8]?？共《局委熓悄壳芭R床上治療CHB最重要和最有效的方法，大量臨床研究和臨床實踐表明，通過長期抗病毒治療，可以抑制HBV復制，顯著改善肝生化學指標，緩解或逆轉(zhuǎn)組織學炎癥和纖維化，延緩疾病進展為肝硬化，降低肝細胞癌發(fā)生率，提高患者長期生存率[9-11]。一線NUC因其具有較好的療效、安全性及較低的耐藥性等優(yōu)點而廣泛應用于臨床，但因其主要機制作用是對于病毒復制的抑制，而不能完全清除肝細胞核內(nèi)半衰期較長的HBV共價閉環(huán)DNA(cccDNA)，故可能出現(xiàn)病毒持續(xù)感染及停藥后肝炎復發(fā)[12]。在應用NUC抗病毒治療中未達停藥指標而自行停藥導致的肝炎復發(fā)率高達80%。停藥復發(fā)肝炎病情往往較重，部分進展為HBV-ACLF，可危及生命[5]。HBeAg是一種由HBV DNA前C和C區(qū)編碼合成的分泌性蛋白[13]，是臨床檢測慢性HBV感染的常用血清學指標[6]。為了探討NUC治療停藥后肝炎復發(fā)致HBV-ACLF患者血清HBeAg的不同狀態(tài)對疾病轉(zhuǎn)歸的影響及可能的原因，本研究對108例停用NUC后肝炎復發(fā)致HBV-ACLF患者進行回顧性分析，結果發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰性組患者的病情好轉(zhuǎn)(生存)率明顯高于HBeAg陽性組，HBeAg陰性組HBV DNA水平明顯低于HBeAg陽性組，提示HBV DNA水平和HBeAg狀態(tài)是CHB患者停用NUC后致HBV-ACLF的預后影響因素。為了探明原因，筆者團隊選取48例長期NUC抗病毒治療達到病毒學應答的患者，分析其不同HBeAg狀態(tài)時血清HBV pgRNA水平的差異，結果發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰性組患者HBV pgRNA載量明顯低于HBeAg陽性組。HBV pgRNA作為一種新型的血清標志物，可以間接反映肝細胞內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。獲得血清學轉(zhuǎn)換的CHB患者常伴隨cccDNA水平降低，提示HBV DNA復制程度降低[14]。因此，本研究結果提示，在停用NUC后肝炎復發(fā)致HBV-ACLF患者中，HBeAg陰性患者的好轉(zhuǎn)率高于HBeAg陽性患者，其可能的原因是：HBeAg陰性患者血清HBV pgRNA處于較低水平，間接反映了其肝細胞內(nèi)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性較低，復制能力下降，其停藥肝炎復發(fā)后血清HBV DNA水平也較低。而停藥后肝炎復發(fā)是否誘導HBV-ACLF的發(fā)生與停藥后HBV DNA是否快速反彈至高病毒載量水平，誘導機體產(chǎn)生過強地針對HBV的免疫反應[15]，從而造成感染HBV的肝細胞大量壞死，導致肝衰竭有關。長期NUC治療后HBeAg仍然陽性的患者血清HBV pgRNA仍處于高水平，提示HBV仍具有較強復制能力，一旦停藥極易復發(fā)，且其HBV DNA極易反彈至較高水平，從而造成免疫性攻擊的肝細胞壞死更為嚴重，導致預后更差。當然，影響停用NUC肝炎復發(fā)致HBV-ACLF的病情轉(zhuǎn)歸因素較多，例如是否合并繼發(fā)感染等并發(fā)癥。但不可否認的是，停藥后HBV DNA反彈所誘導的針對肝細胞的免疫攻擊的強度是決定肝細胞損傷壞死程度并影響預后的關鍵因素。而HBeAg陽性患者由于其HBV cccDNA生物活性更強，HBV DNA反彈更高，因此激發(fā)的免疫攻擊更強，造成的肝壞死更為嚴重，對病情轉(zhuǎn)歸及預后的負面影響更大。

表3 不同臨床轉(zhuǎn)歸患者入院時血清學指標比較

表4 長期NUC治療后不同HBeAg狀態(tài)患者HBV pgRNA水平比較

綜上所述，長期使用NUC 抗病毒治療停藥后肝炎復發(fā)導致HBV-ACLF的HBeAg陰性的患者其臨床轉(zhuǎn)歸優(yōu)于HBeAg陽性患者。因此，針對HBeAg陽性患者，積極勸阻其擅自停藥且在停藥后密切監(jiān)測，對降低HBV-ACLF的發(fā)生率至關重要。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：沈佳聰、李小鵬、張倫理負責課題設計，資料分析，撰寫論文；程曉宇、車媛梅、雷彎參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；周觀林、張倫理負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。