韓雨薇， 陳立剛， 李曉明， 梁國標

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110016

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種嚴重的腦血管疾病，具有較高的病死率與致殘率[1]。有研究顯示，神經(jīng)炎癥被認為是影響SAH預后的關鍵因素之一[2]。神經(jīng)炎性反應涉及小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活，以及隨后的促炎性細胞因子的釋放，這可能在SAH后對鄰近神經(jīng)元造成損害[3]。有研究表明，Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)信號通路可能與SAH后的神經(jīng)炎癥有關，而抑制TLR4可能減輕SAH后的認知障礙和繼發(fā)性腦損傷[4]。冬凌草素是一種二萜類化合物，具有多種生物活性、抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用[5]。有研究表明，冬凌草素通過抑制核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)可減輕炎癥反應的發(fā)生[6]。本研究旨在探討冬凌草素對SAH后早期腦損傷的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 冬凌草素(純度>98%，北京索萊寶科技有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)、TLR4、內(nèi)參蛋白β-actin、細胞B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，NF-κB、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine protease-3，caspase 3)。BCA蛋白定量試劑盒、白酶磷酸酶抑制劑、裂解液(Radio-immunoprecipitation assay，RIPA)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)配制試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒、TUNEL試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技術公司)、PVDF膜、酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物及分組 選取96只8周齡SD雄性大鼠為研究對象。體質(zhì)量280～300 g，來源于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。在標準飼養(yǎng)條件下，恒定溫度濕度，給予充足的食物和水。所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、冬凌草素組，每組各32只。SAH模型制作30 min后，腹腔注射給予藥物冬凌草素1次[7]，冬凌草素以20 mg/ml溶于二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO)，在生理鹽水中稀釋至所需濃度，工作劑量為10 mg/kg。

1.3 研究方法 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，從頸外動脈端(external carotid artery，ECA)向右側(cè)頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)插入尼龍縫線，然后在與大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的分叉處進一步推進3 mm，穿透ICA和MCA的分叉處。假手術組程序相同，但沒有刺穿ICA和MCA的分叉處。將基底池分為6個節(jié)段，根據(jù)出血量的不同，每個區(qū)域的評分從0到3分，總分18分[8]。3組大鼠的神經(jīng)學評估于術后24 h進行。根據(jù)神經(jīng)評分系統(tǒng)評估神經(jīng)功能缺損[9]。平衡木評分共6個等級。0分：能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒；1分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會小于50%；2分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會大于50%；3分：在健側(cè)后肢幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動；4分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；5分：將大鼠放在平衡木上會掉下來。SAH造模后24 h，迅速取出腦組織標本，稱量濕重，在105℃下脫水72 h后，再次稱量干重。左股靜脈注射伊文思藍染料(2%，5 ml/kg)，循環(huán)1 h后，用甲酰胺(10 ml/g)浸泡，60℃孵育24 h，測定620 nm處的吸光度。取蛋白質(zhì)樣品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%BSA在室溫下封閉1 h。將膜與一抗抗體孵育4℃過夜。洗滌后，與二抗在室溫下孵育1 h。通過增強的ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶。采用Western blot法測定大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β表達量。NeuN抗體37℃孵育3 h，加入對應的熒光二抗和TUNEL檢測液，37℃避光孵育1 h。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠SAH評分、神經(jīng)功能評分、平衡木評分比較 與假手術組相比，模型組 SAH評分顯著增加，神經(jīng)功能評分與平衡木評分均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，冬凌草素組SAH評分顯著降低，神經(jīng)功能評分與平衡木評分均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠SAH評分、神經(jīng)功能評分、平衡木評分比較分)

2.2 3組大鼠腦水含量比較 與假手術組相比，模型組左腦、右腦、小腦腦水含量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，冬凌草素組左腦、右腦、小腦腦水含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠腦水含量比較

2.3 3組大鼠伊文思藍滲出量比較 與假手術組相比，模型組左腦、右腦、小腦伊文思藍滲出量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，冬凌草素組伊文思藍滲出量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠伊文思藍滲出量比較

2.4 冬凌草素對TLR4/NF-κB信號通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，SAH后TLR4和NF-κB蛋白表達顯著增加，而冬凌草素給藥能夠顯著抑制SAH介導的TLR4/NF-κB信號通路激活。見圖1。

圖1 冬凌草素對TLR4/NF-κB信號通路的影響(a.蛋白電泳結(jié)果；b.蛋白表達量比較；c.TNF-α含量；d.IL-1β含量)

2.5 冬凌草素對細胞凋亡的影響 SAH后促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達增加，Bcl-2抗凋亡蛋白表達減少。冬凌草素給藥后能夠抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。TUENL染色表明，冬凌草素能夠抑制SAH誘導的神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生。見圖2。

圖2 冬凌草素對細胞調(diào)亡的影響(a.蛋白電泳結(jié)果；b.蛋白表達量比較；c.TUNEL染色)

3 討論

早期腦損傷被認為是SAH后最初24～72 h內(nèi)高病死率與高發(fā)病率的重要原因[10]。多種分子機制參與早期腦損傷的病理生理過程，包括炎癥、血腦屏障破壞和細胞凋亡[11]。炎癥反應包括炎癥細胞的活化和促炎因子的釋放，在SAH后早期腦損傷的發(fā)病機理中起到關鍵作用。過度的炎癥反應會加劇腦水腫、血腦屏障破壞和細胞凋亡[12]。SAH后TLR4/NF-κB信號通路激活，這表明該途徑可能為治療的潛在靶點。TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，并調(diào)節(jié)NF-κB的激活。NF-κB的表達調(diào)節(jié)許多炎癥因子的釋放，這些細胞因子的上調(diào)會加劇SAH后的腦部損傷[13-14]。細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程，在SAH神經(jīng)元細胞死亡起關鍵作用。Caspase-3為Caspase半胱氨酸蛋白酶家族的成員，是一種執(zhí)行凋亡的蛋白質(zhì)，其數(shù)量可以反映凋亡反應的程度。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，Bax是Bcl2家族的促凋亡成員。Bcl2家族的促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的平衡控制著細胞凋亡反應。炎癥反應可加劇細胞凋亡。炎癥反應可加劇細胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，冬凌草素能夠增加神經(jīng)功能評分，減少腦水腫和伊文斯藍滲出量。這表明，冬凌草素具有改善SAH后的早期腦損傷，保護血腦屏障的作用。冬凌草素能夠顯著降低SAH后TLR4/NF-κB信號通路的活化，減少IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達。這表明，冬凌草素能夠抑制炎癥的發(fā)生。此外，冬凌草素可以增加Bcl2的表達，降低Bax和Caspase-3含量。TUNEL染色結(jié)果表明，冬凌草素給藥可以減輕SAH誘導的神經(jīng)元細胞凋亡。這表明，冬凌草素具有抗凋亡的保護作用。

綜上所述，冬凌草素給藥可以在大鼠SAH模型中對早期腦損傷提供神經(jīng)保護作用。