陸云陽 李虎 劉楊 田韻遠 胡晉銘 邱鵬程 湯海峰

海星(starfish)是一類無脊椎底棲海洋動物，以魚蝦貝類為食，屬于棘皮動物門(Echinodermat)海星綱(Asteroidea)。據(jù)統(tǒng)計全球現(xiàn)存海星1900余種，分屬于項鏈海星目(Brisingida)、鉗棘目(Forcipulatida)、樁海星目(Paxillosida)、有棘目(Spinulosida)、瓣海星目(Valvatida)、帆海星目(Velatida)和Notomyotida等7目，共36科約370屬，其中生活在中國周邊海域的約120余種[1]。海星入藥最早見于《本草綱目》，主要作為中國沿海地區(qū)的民間用藥[2]。《中華海洋本草》記載其具有軟堅散結、和胃止痛之功效，主要用于治療甲狀腺腫大、淋巴結核、癭瘤、瘰疬、胃痛泛酸等癥[3]?；瘜W研究表明海星含有甾體、甾體皂苷、蒽醌、生物堿、多肽、磷脂和脂肪酸等多類成分，這些化合物具有腫瘤細胞毒性、溶血、抗病毒、抗真菌和抗其他微生物等多種生物活性[4-6]。中華疣海星(Pentacerasterchinensis)屬于瓣海星目瘤海星科(Oreasteridae)疣海星屬，是在中國南海海域發(fā)現(xiàn)的特有種，而且分布廣泛[7]。目前，針對中華疣海星的化學成分研究報道較少[8-9]。為了闡明其化學成分，為其科學的開發(fā)利用提供依據(jù)，在前期課題組對中華疣海星中的甾體皂苷類成分研究的基礎上[10-11]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振波譜儀(Bruker，德國)；Micromass Quattro質譜儀(Waters，美國)；Dionex P680高效液相色譜儀(Dionex，德國)[配YMC Pack ODS-A色譜柱(250 mm × 20 mm，5 μm；250 mm × 4.6 mm，5 μm)]；Sartorius電子天平(賽多利斯，德國)；柱色譜硅膠100～200目、300～400目(青島海洋化工有限公司，中國)；Sephadex LH-20凝膠(GE Health Care，美國)；C18反相硅膠(Merck，德國)；色譜純乙腈(天津科密歐公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動物樣本

中華疣海星于2015年3月采集于海南省瓊州市以東海域，經(jīng)中國科學院海洋研究所肖寧博士鑒定為中華疣海星Pentacerasterchinensis，標本保存于中國科學院海洋生物標本館。

1.3 提取分離

1.3.1 中華疣海星的提取 中華疣海星總重12 kg(濕重)，鍘刀切碎后用75%乙醇回流提取3次，每次2小時。然后合并3次提取液，用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收乙醇得浸膏。將乙醇浸膏均勻分散于純水中，用等體積的石油醚萃取5次，以除去脂溶性成分。然后，用水飽和正丁醇萃取5次，回收水飽和正丁醇層，即得正丁醇萃取物88 g。

1.3.2 單體化合物的分離 正丁醇萃取物溶解后用硅膠拌樣，然后上硅膠柱色譜進行分離純化，用氯仿—甲醇—水(40∶1∶0 ～ 6.5∶3.5∶1)梯度洗脫，每500 mL收集一次洗脫液，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后合并，總共得19個部分Fr.A-Fr.S。Fr.G(4.47 g)部分，先用Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脫以除去雜質。然后用C18反相硅膠柱色譜進行分離，洗脫液為甲醇—水(1∶3 ～ 1∶0)梯度洗脫，收集洗脫液，每100 mL為一個組分，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后進行合并，最終一共合并得到3個部分(Fr.G1 ～ Fr.G3)。其中Fr.G2(60.5 mg)通過半制備高效液相色譜進行分離純化，流動相為68%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分離得到化合物1(4.0 mg)和2(9.6 mg)。

Fr.H(2.94 g)部分用Sephadex LH-20凝膠柱進行純化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脫以除去雜質。經(jīng)過凝膠柱純化后的Fr.H部分繼續(xù)上C18反相硅膠柱色譜進行分離，洗脫液為甲醇—水(1∶3 ～1∶0)，收集洗脫液，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后進行合并，最終從Fr.H部分共得到3個部分(Fr.H1 ～ Fr.H3)。其中Fr.H2(85 mg)通過半制備高效液相色譜進行分離純化，流動相為70%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分離得到化合物3(15.0 mg)和4(12.2 mg)。

2 結果

2.1 結構鑒定

通過綜合分析分離所得化合物1～4的核磁和質譜數(shù)據(jù)，解析出其化學結構(圖1)。詳細解析過程如下。

2.2 化合物1

化合物1，白色粉末，Liebermann-Burchard反應呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。電噴霧質譜(Electron Spray Ionization-Mass Spectrum, ESI-MS)給出其準分子離子峰為m/z457 [M + Na]+和m/z433 [M - H]-，結合化合物的核磁共振碳譜(13C Nuclear Magnetic Resonance,13C NMR)數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H46O4。

綜合分析其1H NMR和13C NMR信號，發(fā)現(xiàn)化合物分子中存在5個甲基，其碳氫化學位移分別為δH0.98 (s)與δC15.2 (C-18)、δH0.89 (s)與δC14.0 (C-19)、δH1.01 (d,J= 6.3 Hz)與δC20.4

圖1 從中華疣海星中分離鑒定到的

(C-21)、δH0.91 (d,J= 6.5 Hz)與δC18.6、δH0.86(d,J= 6.5 Hz)與δC18.5；一個雙鍵δH5.52與δC138.5和δH5.42 (dd,J= 14.8, 6.8 Hz)與δC130.2；以及4個連氧次甲基δH3.48與δC72.3、δH3.39與δC69.8、δH4.12與δC70.5、δH3.65與δC78.7。以上特征NMR信號表明化合物1可能是一個多羥基甾醇類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)和HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)譜數(shù)據(jù)，對化合物的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。根據(jù)化合物1H-1H COSY(1H-1H correlation spectroscopy)譜的相關信號，可以得到連續(xù)的結構片段：H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9、H-9/H-11/H-12、H-8/H-14/H-15/H-16/H-17、H-17/H-20/H-21、H-20/H-22/H-23/H-24/H-25/H-26/H-27。在HMBC譜中H3-19與C-1、C-5、C-9和C-10相關，H3-18與C-12、C-13、C-14和C-17相關，H3-21與C-17、C-20和C-22相關，H3-26與C-24、C-25和C-27相關；H-22與C-17和C-20相關，H-23與C-20、C-24和C-25相關，從而可構建化合物1的平面結構，并表明雙鍵位于C-22(C-23)位。根據(jù)H-23的偶合常數(shù)J= 14.8推測雙鍵為反式構型。在NOESY(Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)譜中，H-3與H-5相關，表明H-3為α構型；H-6與H-8和H3-19相關，表明H-6是β構型；H-14與H-15和H-17相關，表明H-15是α構型。通過與文獻中具有22E-雙鍵-24-羥基的化合物中C-24位碳氫核磁數(shù)據(jù)的對比，表明化合物1的C-24為R構型。綜上所述，鑒定化合物1的結構為(24R, 22E)-膽甾-22-烯-3β,6α,15β,24-四醇，即已知化合物certonardosterol G，其波譜數(shù)據(jù)與文獻一致[12]。

2.3 化合物2

化合物2，白色無定形粉末，Liebermann-Burchard反應呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z473 [M+Na]+和m/z449 [M-H]-，結合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H46O5。

化合物的1H NMR譜中存在5個甲基氫信號，包括2個單峰甲基氫δH0.96和1.28、3個雙峰甲基氫δH0.88 (J=6.7 Hz)、0.90 (J=6.7 Hz)和0.99 (J=6.5 Hz)。還存在2個烯氫信號δH5.53、δH5.45 (dd,J=15.0, 6.5 Hz)；4個連氧次甲基氫信號δH3.48、3.65、3.86和4.40。通過HSQC譜找到與以上氫信號對應的甲基碳信號分別為δC14.2、16.5、18.6、18.5和20.4，雙鍵碳信號為δC138.6和132.5，連氧次甲基碳信號為δC72.0、78.9、68.2和70.5。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對化合物2的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。對比化合物2與化合物1的核磁數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩個化合物具有相似的化學結構。不同點在于與化合物1相比，化合物2的碳信號中少了一個δC32.2次甲基碳信號，多了一個δC77.7連氧季碳信號。2D NMR分析表明，化合物2為化合物1的C-8位羥基取代產(chǎn)物，由生源途徑分析推測8-OH為β構型。因此，確定化合物2的結構為(24R, 22E)-膽甾-22-烯-3β,6α,8β,15β,24-五醇，其波譜數(shù)據(jù)與文獻中報道的已知化合物一致[13]。

2.4 化合物3

化合物3，白色無定形粉末，Liebermann-Burchard反應呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z475 [M + Na]+和m/z451 [M-H]-，結合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H48O5。

分析化合物的1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物分子中存在4個甲基信號，碳氫化學位移分別為δH0.93 (s)與δC16.4 (C-18)、δH0.85 (s)與δC13.6 (C-19)、δH0.96 (d,J= 6.5 Hz)與δC18.3 (C-21)、δH0.95 (d,J= 6.8 Hz)與δC17.6 (C-27)；另有4個連氧次甲基信號，碳氫化學位移分別為δH3.49與δC71.9、δH3.35與δC69.8、δH4.12與δC70.3、δH4.29與δC72.8；1個連氧亞甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.7 Hz)/3.68 (dd,J= 10.1, 6.8 Hz)與δC67.9。以上特征信號表明化合物3是一個多羥基甾醇類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對化合物3的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。結合2D NMR分析，通過檢索發(fā)現(xiàn)化合物3與文獻報道的化合物(25S)-膽甾-3β,6α,15β,16β,26五醇波譜數(shù)據(jù)一致，從而確定了其結構[14]。

表1 化合物1～4的13C NMR (CD3OD, 125 MHz)和1H NMR (CD3OD, 500 MHz)數(shù)據(jù)

2.5 化合物4

化合物4，白色粉末，Liebermann-Burchard反應呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z491 [M + Na]+和m/z467 [M-H]-，結合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H48O6。

根據(jù)化合物4的1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對其所有的碳氫信號進行了歸屬(表1)。分析上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，化合物分子結構中有4個甲基信號，其碳氫化學位移分別為δH1.19 (s)與δC17.6 (C-18)、δH0.98 (s)與δC13.7 (C-19)、δH0.95 (d,J= 6.0 Hz)與δC18.2 (C-21)、δH0.94 (d,J= 6.7 Hz)與δC17.5 (C-27)；4個連氧次甲基信號，其碳氫化學位移分別為δH3.55與δC71.7、δH3.86與δC67.1、δH4.43與δC70.7、δH4.25與δC73.1；1個連氧亞甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.8 Hz)/3.66 (dd,J= 10.2, 6.9 Hz)與δC67.8；1個連氧季碳δC76.7。以上特征數(shù)據(jù)表明，化合物4是一個多羥基甾醇類化合物。通過比對化合物4和化合物3的碳氫數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩個化合物具有相似的化學機構，不同點在于化合物4的結構中少了一個次甲基(δH1.92與δC31.3)，而多了一個連氧季碳(δC76.7)。以上信息表明化合物4是化合物3的羥基取代產(chǎn)物，2D NMR分析表明羥基取代于C-8位，由生源途徑分析推測8-OH為β構型。綜上所述，確定化合物4的結構為(25S)-膽甾-3β,6α,8β,15β,16β,26-六醇，其波譜數(shù)據(jù)與文獻中報道的已知化合物一致[15]。

3 討論

海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，其中的海洋生物孕育了大量具有特殊化學結構和多樣生物活性的物質。然而，目前對海洋生物資源的開發(fā)利用仍十分有限。中華疣海星是中國的特有海洋生物品種，在中國南海分布廣泛，種群數(shù)量巨大，亟待開發(fā)。本文運用色譜分離技術和波譜解析技術從中華疣海星中分離鑒定了4個多羥基甾醇類化合物，均為首次從該屬海星中分離得到，從而為中華疣海星成分多樣性提供了實驗數(shù)據(jù)支持。后續(xù)將開展該動物化學成分藥理活性方面的研究，為其資源的進一步開發(fā)提供充足的科學依據(jù)。