祝梅斐 李珊珊 胡福良

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

1 引言

蜂膠是蜜蜂工蜂采集植物樹脂，并混入其上顎腺和蠟腺的分泌物形成的粘性物質(zhì)。蜜蜂利用蜂膠填補(bǔ)蜂巢空隙、抑制病菌侵襲、包埋入侵者尸體。蜂膠中含有20 多類500 多種化學(xué)成分，已經(jīng)被證實(shí)具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂血糖等廣泛而顯著的生物學(xué)活性[1]。蜂膠的化學(xué)成分極為復(fù)雜，其中也存在一些無(wú)明顯藥用價(jià)值的成分甚至有毒成分，加上蜂膠在水中的溶解度很低，部分溶于有機(jī)溶劑，所以蜂膠的提取工藝是充分利用蜂膠生物活性成分的關(guān)鍵步驟，選擇一個(gè)合適的提取工藝對(duì)于生產(chǎn)高質(zhì)量、高性價(jià)比的蜂膠產(chǎn)品至關(guān)重要。

本文在對(duì)蜂膠常用的提取方法作簡(jiǎn)要介紹的基礎(chǔ)上，著重介紹固相萃取、天然低共熔溶劑和高壓萃取等三種新型提取方法的特點(diǎn)及其在蜂膠提取中應(yīng)用的可行性，為尋求適宜的蜂膠提取新方法和建立標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

2 蜂膠的常用提取方法

蜂膠提取最常用的方法是浸漬法（Maceration），使用最多的溶劑是乙醇-水混合物。目前已有大量文獻(xiàn)研究不同因素對(duì)提取效果的影響，包括溶劑類型、固液比、提取時(shí)間、溫度等。Yong 等[2]研究發(fā)現(xiàn)濃度為60%～80%的乙醇提取物的活性高于濃度為40%～60%和80%～95%的乙醇提取物。一般通過(guò)蜂膠提取物的含量、總酚和總黃酮的提取含量，抗菌和抗氧化的活力等因素來(lái)評(píng)價(jià)其提取效果。比較理想的浸漬時(shí)間為10d 左右，較長(zhǎng)的浸漬時(shí)間（20d 或30d）所產(chǎn)生的液體提取物得率有輕微的增加，但多酚的含量無(wú)顯著變化[3]。蜂膠的活性成分復(fù)雜，極性各不相同，為了更多地利用蜂膠中的活性成分，除了乙醇，也有采取其他溶劑的研究，如水、油、乙二醇、丙二醇、乙酸乙酯、石油醚等。不同溶劑提取得到的生物成分和活性均有不同。馬士巧等[4]對(duì)東北黑蜂蜂膠不同極性提取物的提取率和體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定和比較，其中甲醇和乙醇提取物中的黃酮和三萜含量最高，多酚含量較高；而水提物的提取率僅有5.82%，但多酚含量最高；甲醇和乙醇的提取物抗氧化活性最強(qiáng)，而苯提取物較低。

索氏提取法（Soxhlet extraction）也是提取蜂膠活性成分的常用方法，在浸漬過(guò)程的基礎(chǔ)上采用索氏裝置提取，可以加快提取速率，并在一定程度上提高提取效率。與浸漬法相比，該方法主要的優(yōu)點(diǎn)在于溶劑用量少，溶劑可循環(huán)使用以及提取時(shí)間較短。Biscaia等[5]發(fā)現(xiàn)采用索氏提取法，溶劑為無(wú)水乙醇，提取6h，溫度為60℃，質(zhì)量濃度為5 ∶150 時(shí)，所得提取率最高；但是該方法應(yīng)謹(jǐn)慎使用，因?yàn)榉淠z長(zhǎng)期暴露于高溫環(huán)境中會(huì)破壞其中受熱不穩(wěn)定的化學(xué)成分，而且會(huì)增加蜂膠中蠟物質(zhì)的溶解。Archaina 等[6]采用不同濃度的乙醇浸漬提取法和索氏提取法（60℃）提取阿根廷無(wú)刺蜂蜂膠，發(fā)現(xiàn)索氏提取法雖然有較高的提取率，但總酚和黃酮類化合物含量較低，抗氧化活性也有所降低。

近年來(lái)，超聲波輔助萃取技術(shù)（Ultrasound-assisted extraction,UAE）應(yīng)用于提取蜂膠中的活性成分。其原理是利用超聲振動(dòng)改變物質(zhì)的形態(tài)與功能，或者加速這些改變的過(guò)程，現(xiàn)在普遍認(rèn)為超聲波技術(shù)提取的三大依據(jù)是超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。UAE 可以大大縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑用量，而且超聲波提取過(guò)程中不需要加熱，可以最大限度地保護(hù)蜂膠中的活性成分，提高提取效率。另一種技術(shù)微波輔助萃取技術(shù)（Microwave-assisted extraction,MAE），是利用微波能量加熱與樣品接觸的溶劑，以便使基質(zhì)中的一些化學(xué)成分轉(zhuǎn)移至溶劑中的過(guò)程，也是一種提取蜂膠黃酮的省時(shí)、高效的方法。與傳統(tǒng)浸提法相比，MAE 具有溶劑用量少、提取效率高、提取時(shí)間短等特點(diǎn)。相較于浸漬法和UAE，MAE 顯然是一種更快速的提取方式，而且提取效率較高。Trusheva等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在MAE 條件下（800 W；2×10s，得率73%～75%）的提取率高于UAE（30min，得率41%～53%）和傳統(tǒng)浸提法（72h，得率55%～58%）。但是，Trusheva 等[7]和Oroian 等[8]研究發(fā)現(xiàn)微波輻射可能由于降解過(guò)程導(dǎo)致提取的活性成分比例減少，所以考慮到提取率和較短的提取時(shí)間，UAE 是更有效的提取方式。

超臨界流體CO2技術(shù)（Supercritical CO2extraction，SC-CO2）在近幾十年發(fā)展迅速，超臨界流體在工業(yè)中被用作綠色環(huán)境友好溶劑，CO2由于在加工過(guò)程中安全、低成本、再生簡(jiǎn)單、可抑制氧化等特點(diǎn)，常被用作超臨界萃取溶劑。但是，SC-CO2是非極性的，極性化合物在其中的溶解度較差，導(dǎo)致不同類型蜂膠提取物中的生物活性成分含量較低。為了增強(qiáng)極性和獲得更多富含極性生物活性成分的提取物，加入乙醇和甲醇可作為蜂膠的助溶劑[9]。Machado 等[10]研究發(fā)現(xiàn)SC-CO2萃取的巴西蜂膠提取物中含有的阿替匹林C和香豆素含量高于傳統(tǒng)乙醇提取物，但是活性低于傳統(tǒng)乙醇提取物。目前SC-CO2成功應(yīng)用于蜂膠無(wú)水乙醇提取物的分離，獲得富含特定價(jià)值成分的餾分：巴西綠蜂膠的異戊烯基肉桂酸[11]和巴西紅蜂膠的聚烯丙基二苯甲酮[12]。

3 蜂膠的新型提取方法

3.1 固相萃?。⊿olid phase extraction,SPE）

固相萃取（SPE）是結(jié)合了液固萃取和液相色譜兩大技術(shù)發(fā)展而形成的樣品前處理技術(shù)。傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)的原理是利用固體吸附劑吸附目標(biāo)物，使目標(biāo)物與其它基質(zhì)分離，再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)物的目的[13]。現(xiàn)在也已出現(xiàn)一些新型SPE 技術(shù)，可以減少人為因素造成的誤差。為了獲得高萃取回收率，選擇合適的固體吸附劑始終是關(guān)鍵的步驟。與液-液萃?。↙LE）相比，SPE 具有回收率高、分離速度較快、不易產(chǎn)生乳化、溶劑用量減少等優(yōu)點(diǎn)；與高效液相色譜（HPLC）相比，SPE 的分離效率低，可用于分離差別很大的化合物；對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜、含量較低的目標(biāo)物，采用SPE 法，主要起到凈化、富集的作用。

早在1962 年，Anton 等[14]就首次對(duì)SPE 技術(shù)進(jìn)行了研究，并采用氧化鋁作為吸附劑來(lái)凈化樣品，純化效果良好。一次性SPE 商品柱出現(xiàn)在1978 年。自SPE 出現(xiàn)以來(lái)，就一直以10%的年增長(zhǎng)率擴(kuò)大其應(yīng)用[15]。SPE 在我國(guó)起步較晚，早期使用固相萃取有機(jī)、無(wú)機(jī)樣品居多，處理體液等生物樣品的報(bào)道較少。但近20 多年來(lái)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、食品分析、藥物分析、材料分析和化學(xué)分析中。

在提取蜂膠方面，目前SPE 未被建議用于大規(guī)模的制備應(yīng)用，但實(shí)驗(yàn)室條件下已有多項(xiàng)研究采用該方法。劉?等[16]和王春玲[17]采用大孔樹脂從乙醇提取物中提取蜂膠黃酮類物質(zhì)，純度達(dá)90%以上。Li 等[18]采用微孔吸附樹脂對(duì)蜂膠水餾分中的多酚進(jìn)行了分離。目前SPE 更多的是與分析儀器聯(lián)合使用，相互補(bǔ)充，擴(kuò)大使用范圍，實(shí)現(xiàn)了前處理及分離分析的優(yōu)化組合，如固相萃取-液相色譜。楊黎等[19]采用HLB 與NH2固相萃取柱凈化，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂膠、蜂膠保健食品中的氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素的方法，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、適用性強(qiáng)。楊雯筌等[20]將樣品經(jīng)固相萃取、衍生、乙酸乙酯提取后進(jìn)行質(zhì)譜分析，建立了蜂膠中硝基呋喃類代謝物液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。張睿等[21]對(duì)樣品用陽(yáng)離子固相萃取小柱凈化，建立用HPLC-MS/MS 同時(shí)檢測(cè)蜂膠中磺胺及林可胺類藥物殘留的方法，該方法回收率良好，檢測(cè)限較低。李俊玲等[22]用正己烷固相萃取蜂膠中的多環(huán)芳烴，用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，結(jié)果顯示準(zhǔn)確度、精密度良好。廖夏云等[23]通過(guò)HLB SPE 小柱凈化目標(biāo)成分，建立同時(shí)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂膠膠囊中多種硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單可靠，重復(fù)性好，推廣應(yīng)用前景較好。Simsek 等[24]開發(fā)了一種基于固相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的可靠且具有選擇性的方法，用于測(cè)定蜂膠中的有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯和多溴二苯醚。

3.2 天然低共熔溶劑（natural deep eutectic solvent，NADES）

隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的密切關(guān)注和對(duì)綠色化學(xué)的倡導(dǎo)，尋求一種新的低成本、無(wú)污染的綠色溶劑來(lái)提取生物活性天然化合物的需求也日益強(qiáng)烈。在過(guò)去的十多年中，天然低共熔溶劑（NADES）得到了發(fā)展。2003 年，Abbott 等[25]首次提出低共熔溶劑（DESs）是一種由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）以一定比例混合加熱攪拌形成的液態(tài)混合物，而天然低共熔溶劑（NADES）的概念在2011 年由Choi 等[26]首次提出，是一種自然界中存在的類似DESs 的物質(zhì)，以生物體的初級(jí)代謝產(chǎn)物分別作為HBA、HBD 混合形成的物質(zhì)。由于NADES 由天然產(chǎn)物組成，與DES相比，具有成本更低、易于制備、毒性更小、可持續(xù)性更好，具有較寬的極性范圍以及極性可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[27]，雖然NADES 的研究剛剛起步，但在多方面應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的NADES 均是人為地將某些初級(jí)代謝產(chǎn)物按一定比例混合制備而成的。

NADES 的生物相容性較好，可在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用，如增加藥物溶解度、穩(wěn)定性和滲透性，促進(jìn)藥物口服吸收，作為藥物活性成分等[28]。在天然生物活性成分提取方面，NADES 的溶解能力較強(qiáng)，采用該溶劑得到的萃取率高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，在提取和儲(chǔ)存過(guò)程中可增加天然化合物的穩(wěn)定性[29]。在農(nóng)產(chǎn)品殘留物處理應(yīng)用方面，目前研究文獻(xiàn)顯示有望利用NADES推進(jìn)現(xiàn)有的生物煉制方法，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)殘留清潔分餾或預(yù)處理[30]。NADES 也廣泛應(yīng)用于化學(xué)領(lǐng)域，如用于合成、催化等。Wu 等[31]采用NADES 作為催化劑，通過(guò)分子間氫鍵活化途徑實(shí)現(xiàn)了活化炔烴的選擇性硒化，轉(zhuǎn)化率為100%，選擇性為93%。

在蜂膠提取的應(yīng)用中，水-乙醇溶劑是最常用的提取蜂膠活性成分的有效溶劑，但由于部分人群對(duì)乙醇不耐受，所以用于食品或保健品中的蜂膠乙醇提取物并不適用于所有消費(fèi)者，也不符合綠色提取的原則。而作為天然產(chǎn)物的NADES，具有極性范圍寬且可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，de los Angeles Fernandez 等[27]采用基于NADES的超聲輔助萃取法提取農(nóng)副產(chǎn)品中的酚類物質(zhì)。已有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)試了一些NADES 代替水-乙醇提取蜂膠活性成分的作用；其中適合提取巴西綠蜂膠的溶劑是氯化膽堿-丙二醇或氯化膽堿-乳酸[32]，適合提取楊樹型蜂膠的溶劑是氯化膽堿L（＋）酒石酸[33]和檸檬酸-丙二醇[34]。最近，有研究者提出，天然低共熔溶劑的組分可以提高溶解的生物活性成分的活性[35]。Trusheva等[34]利用天然低共熔溶劑提取蜂膠的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)這一點(diǎn)。這使得將獲得的具有良好活性的蜂膠提取物直接引入到配方中成為可能，避免了難以從具有粘性和低蒸汽壓的天然低共熔溶劑中回收溶質(zhì)。

NADES 作為一種新型的綠色溶劑，已經(jīng)被證明比傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑更有效，可以提高蜂膠提取物的得率，不過(guò)也存在缺點(diǎn)，主要是很難從提取的化合物中將NADES 分離出來(lái)。但是通過(guò)使用NADES 來(lái)提取僅由無(wú)毒食品添加劑組成的食品或藥品，就沒有必要將它從提取的化合物中分離出來(lái)[32]。

3.3 高壓萃取法（High pressure extraction，HPE）

高壓萃取是指在常溫下用100～800MPa 的流體靜壓力施加于材料，使用與傳統(tǒng)提取法相同的溶劑在高壓作用下滲透入物料內(nèi)部，保持壓力使物料內(nèi)外壓力達(dá)到平衡，一定時(shí)間后迅速卸壓，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生較大的滲透壓力差使得物料中的有效成分轉(zhuǎn)移至提取溶劑中，從而完成提取過(guò)程[36]。高壓應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)各種各樣的現(xiàn)象去促進(jìn)體積減小的方向誘導(dǎo)反應(yīng)，從而提高萃取效率（例如從一種形式到另一種形式的相變，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的變化，分子結(jié)構(gòu)的變化等）[37]。

高壓技術(shù)發(fā)展迅速，且應(yīng)用廣泛，最初應(yīng)用于陶瓷、金屬等材料加工領(lǐng)域，在20 世紀(jì)80 年代后期逐漸應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[38]。2004 年，張守勤等[39]首次提出將高壓技術(shù)作為提取方法，并以中草藥進(jìn)行了適用性研究；發(fā)現(xiàn)使用HPE 在室溫下工作可以避免一些熱敏性化合物受熱變性，而且萃取時(shí)間極短，得率較高，能節(jié)省大量能源，安全性也更高。

關(guān)于HPE 在蜂膠提取中的應(yīng)用，張守勤等[39]研究發(fā)現(xiàn)高靜壓萃取（High hydrostatic pressure extraction,HHPE）浸提1min 的黃酮化合物得率高于室溫浸提法7d、熱回流浸提4h 的得率，證明該方法可以快速提取蜂膠中的黃酮化合物，且優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法。席軍等[40]分別采用HHPE、室溫浸提法和熱回流浸提法對(duì)蜂膠乙醇提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇提取物（EEP）的抗氧化活性隨著提取物濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，經(jīng)HHPE 和室溫浸提（LRT）出的EEP 具有較強(qiáng)的抗氧化活性，而且兩種提取法的提取物抗氧化活性相同，但是LRT 通常需要7d，HHPE只需1min。通過(guò)比較提取時(shí)間、提取效率和抗氧化活性，HHPE 比常規(guī)提取方法更有效。還有一種方法稱為加壓溶劑萃?。≒SE），也稱為加速溶劑萃?。ˋSE），利用了萃取的溫度依賴性。溫度的升高加速了提取速率，而壓力的升高防止了溶劑在高于正常沸點(diǎn)的溫度沸騰。采用該方法，在含有29%天然表面活性劑的情況下，用熱加壓水提取巴西蜂膠[41]，用乙醇-水提取土耳其蜂膠[42]，效果良好；兩種提取物均具有良好的抗自由基活性。

總之，HPE 是一種可應(yīng)用于蜂膠活性成分提取的有效方法，萃取時(shí)間極短，提取效率高，而且沒有溶劑揮發(fā)，符合綠色環(huán)保要求。目前主要在實(shí)驗(yàn)室中使用該方法，操作簡(jiǎn)單，但該方法需要高度專業(yè)化的設(shè)備。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，蜂膠的經(jīng)典提取方法和新型提取方法得到了應(yīng)用和發(fā)展。不同提取方法可針對(duì)不同類型蜂膠或蜂膠中不同類型的化合物來(lái)選擇，目前最常用的溶劑還是乙醇-水混合物，考慮到對(duì)綠色化學(xué)和生態(tài)環(huán)境的關(guān)注，未來(lái)像天然低共熔溶劑這類的綠色溶劑將會(huì)有理想的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。綜合評(píng)價(jià)上述的提取方法，均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為尋求一種可以廣泛應(yīng)用于不同類型蜂膠中生物活性成分提取的最佳方法還需要更多的研究。