王海鵬， 劉 屹， 李東輝， 沈光輝

1 陜西省人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 西安 710068；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 三病區(qū)， 陜西 咸陽 712000

肝細(xì)胞癌(HCC)可誘導(dǎo)機(jī)體CD8+T淋巴細(xì)胞功能麻痹甚至功能衰竭，不能有效發(fā)揮抗腫瘤活性，造成患者疾病進(jìn)展[1-2]，但HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭的機(jī)制尚未完全闡明。白細(xì)胞介素-33(IL-33)是IL-1細(xì)胞因子家族成員，主要通過其受體腫瘤抑制素2(suppression of tumorigenicity 2, ST2)發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。IL-33可通過增強(qiáng)效應(yīng)性CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞功能、抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[4-5]，但有關(guān)IL-33在HCC患者中的表達(dá)變化及其對CD8+T淋巴細(xì)胞功能調(diào)控作用的研究報(bào)道較少。因此，本研究檢測HCC患者外周血IL-33水平，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)觀察IL-33對HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞活性的影響和可能的機(jī)制，初步探討IL-33在HCC發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年4月—2020年1 月陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收住的HCC患者44例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲且<70歲；(2)診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[6]的標(biāo)準(zhǔn)；(3)未接受手術(shù)、介入、免疫、靶向等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并人獲得性免疫缺陷病毒感染；(3)合并自身免疫性疾病或長期使用免疫抑制劑；(4)妊娠期或哺乳期婦女。選擇同時期在本院進(jìn)行查體的健康者20例作為對照組。

1.2 儀器與試劑 美國Sigma 3-16K離心機(jī)；德國美天旎公司MACS LS分離柱和MACS磁力分離架；美國伯樂iMark微孔讀板儀；美國Applied Biosystem公司ABI7500實(shí)時定量PCR儀；德國AID公司酶聯(lián)斑點(diǎn)吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT)讀板儀；美國BD公司FACS Aria II流式細(xì)胞儀。人外周血淋巴細(xì)胞分離液(密度：1.077 g/ml)(貨號：P8610)購自北京索萊寶科技有限公司；人CD8+細(xì)胞分選試劑盒(貨號：130-096-495)購自德國美天旎公司；重組人IL-33(貨號：200-33)購自美國Peprotech公司；人IL-33(貨號：CSB-E13000h)、人ST2(CSB-E13789h)、人IFNγ、人TNFα酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物公司；Trizol試劑(貨號：15596018)購自美國Invitrogen公司；PrimeScript預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR036A)和TB Green預(yù)混Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)實(shí)時定量PCR試劑盒(貨號：RR82LR)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8, CCK-8)(貨號：C0037)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)細(xì)胞毒性檢測試劑盒(貨號：C0016)購自武漢碧云天生物技術(shù)公司；人穿孔素ELISPOT試劑盒(貨號：ab62943)和人顆粒酶B ELISPOT試劑盒(貨號：ab62922)購自美國Abcam公司；小鼠抗人CD3-PE CF594(貨號：562280)、小鼠抗人CD8-APC Cy7(貨號：348793)、小鼠抗人程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)-FITC(貨號：557860)、小鼠抗人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)-PE(貨號：555853)購自美國BD 公司；小鼠抗人淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)-PerCP-eFluor710(貨號：46-2231-82)購自美國ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 血漿和外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的分離 HCC患者和對照者于清晨空腹采集EDTA抗凝外周血20 ml。1000 r/min離心10 min，取上層血漿凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用人外周血淋巴?xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離PBMC，凍存于液氮中備用。

1.3.2 CD8+T淋巴細(xì)胞分選 使用德國美天旎公司人CD8+細(xì)胞分選試劑盒對28例HCC患者和11例健康對照者PBMC中的CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行純化。取107個PBMC，4 ℃、300 r/min離心10 min，棄上清后保留細(xì)胞沉淀，加入40 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL生物素標(biāo)記的人CD8+細(xì)胞抗體雞尾酒(其中包含生物素標(biāo)記的抗CD4、抗CD15、抗CD16、抗CD19、抗CD34、抗CD36、抗CD56、抗CD123、抗TCRγ/δ、抗CD235a)，4 ℃孵育5 min，加入30 μL緩沖液，并加入20 μL人CD8+細(xì)胞MicroBead雞尾酒(其中包含MicroBead標(biāo)記的抗CD14、抗CD61、抗生物素)，4 ℃孵育10 min，加入緩沖液調(diào)整總體積至500 μL。將MACS LS分離柱置于MACS磁力分離架的分離區(qū)，加入3 mL緩沖液充分浸潤，然后將上述細(xì)胞懸液加入LS分離柱中，在重力作用下使細(xì)胞懸液穿過分離柱，收集穿過分離柱的未標(biāo)記細(xì)胞即為純化的CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 純化的CD8+T淋巴細(xì)胞使用重組人IL-33(5 ng/mL)刺激培養(yǎng)，同時加入抗CD3/抗CD28維持T淋巴細(xì)胞活性，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。選擇HLA-A02限制性HCC患者(11例)和對照者(6例)，取104個IL-33刺激后的CD8+T淋巴細(xì)胞與105個HLA-A02限制性的HCC細(xì)胞系HepG2細(xì)胞[7]共培養(yǎng)，向培養(yǎng)液中加入抗CD3/抗CD28維持T淋巴細(xì)胞活性，培養(yǎng)48 h后收集上清。

1.3.4 ELISA法檢測血漿和培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子 使用商品化的ELISA試劑盒對血漿中IL-33、ST2和培養(yǎng)上清中IFNγ、TNFα水平進(jìn)行檢測。向抗體包被的ELISA平板中加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，37 ℃孵育2 h，棄去液體，不洗滌，加入100 μL生物素標(biāo)記抗體工作液，37 ℃孵育1 h，棄去液體，洗滌5次，加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶結(jié)合工作液，37 ℃孵育30 min，棄去液體，洗滌5次，加入90 μL TMB溶液，37 ℃避光孵育15 min，加入50 μL終止液，在450 nm波長處測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣本中相關(guān)因子的水平。

1.3.5 實(shí)時定量PCR法檢測PBMC中IL-33和ST2 mRNA相對表達(dá)量 使用Trizol試劑對PBMC中的總RNA進(jìn)行提取。取1 μg總RNA，使用PrimeScript預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系：4 μL 5×PrimeScript反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶混合物Ⅰ、1 μL 寡聚核苷酸引物(50 μmol/L)、1 μL 隨機(jī)六引物(100 μmol/L)、1 μg總RNA，加入DEPC 處理H2O調(diào)整總體積至20 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s。使用TB Green預(yù)混Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)實(shí)時定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，實(shí)時定量PCR體系：10 μL TB Green預(yù)混Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×)、0.8 μL PCR上游引物(10 μmol/L)、0.8 μl PCR下游引物(10 μmol/L)、0.4 μL ROX參考染料Ⅱ(50×)、2 μL cDNA模板、6 μL滅菌水，總體積為20 μL，實(shí)時定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s 1個循環(huán)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)。使用ABI7500實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法以內(nèi)參照基因?yàn)閷φ者M(jìn)行半定量分析。PCR引物序列參照既往發(fā)表文獻(xiàn)[8]合成。

1.3.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 使用CCK-8試劑盒對細(xì)胞增殖進(jìn)行分析。在培養(yǎng)的最后4 h，向培養(yǎng)液中加入10% CCK-8工作液，培養(yǎng)結(jié)束后立即在450 nm波長處測定吸光度，根據(jù)已知細(xì)胞數(shù)量的OD450nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣本細(xì)胞數(shù)量。

1.3.7 ELISPOT法檢測CD8+T淋巴細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B水平 將無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激的CD8+T淋巴細(xì)胞加入預(yù)包被的ELISPOT平板中，加入植物血凝素(100 ng/mL)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，棄去液體，洗滌3次，加入100 μL鏈霉親和素堿性磷酸酶耦合物，室溫孵育60 min，棄去液體，洗滌3次，加入100 μL BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑，室溫孵育15 min，終止反應(yīng)，洗滌后使用ELISPOT讀板儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量表示陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例和CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、LAG-3和CTLA-4比例 PBMC轉(zhuǎn)入FACS管中，洗滌后加入小鼠抗人CD3-PE CF594、小鼠抗人CD8-APC Cy7，室溫避光孵育30 min，洗滌后加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定。將無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激的CD8+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入FACS管中，洗滌后加入小鼠抗人CD8-APC Cy7，室溫避光孵育30 min，洗滌后加入100 μL固定液，室溫避光孵育30 min后， 加入2 mL透化液，室溫400 r/min離心5 min，棄上清，加入100 μL透化液，然后加入小鼠抗人PD-1-FITC、小鼠抗人LAG-3- PerCP-eFluor710、小鼠抗人CTLA-4-PE，室溫避光孵育30 min，加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定，使用FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞，使用FlowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.3.9 靶細(xì)胞死亡比例檢測 使用LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒對CD8+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡比例進(jìn)行檢測。在培養(yǎng)的最后1 h，將細(xì)胞培養(yǎng)板于400 r/min離心5 min，加入150 μL LDH釋放試劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，培養(yǎng)結(jié)束后吸取120 μL上清液，加入新的96孔板中，各孔中加入60 μL LDH檢測工作液，室溫避光孵育30 min，然后在490 nm處測定吸光度。以HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH吸光度為“對照值”，以Triton X-100處理的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH吸光度為“最大活性值”，靶細(xì)胞死亡比例(%)=(待測樣本值-對照值)/(最大活性值-對照值)×100%。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會，批號：省醫(yī)倫2017-082號，所有患者或家屬行告知并簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 HCC組44例，均有HBV感染史，對照組20例，兩組在性別比例、年齡方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；但HCC組AFP顯著高于對照組(P<0.001)(表1)。

2.2 HCC患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例、IL-33和ST2水平變化 HCC組和對照組外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞典型流式分析圖見圖1。HCC組血漿IL-33水平顯著低于對照組，HCC組PBMC中IL-33 mRNA相對表達(dá)量亦顯著低于對照組(P值均<0.001)(表2)。外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例與血漿IL-33、血漿ST2水平無顯著相關(guān)性(P值均>0.05)(圖2)。

2.3 IL-33對HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制 105個純化的CD8+T淋巴細(xì)胞(28例HCC患者和11例對照者)使用重組人IL-33刺激24 h后，無論HCC組還是對照組純化的CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖水平在無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。在無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激的情況下，HCC組CD8+T淋巴細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B的水平顯著低于對照組；經(jīng)IL-33刺激后兩組CD8+T淋巴細(xì)胞分泌孔素和顆粒酶B的水平均顯著升高(P值均<0.05)。HCC組和對照組CD8+T淋巴細(xì)胞無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激后PD-1、LAG-3和CTLA-4表達(dá)的典型流式分析圖見圖3。在無IL-33刺激的情況下，HCC組CD8+T淋巴細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)分子(PD-1、LAG-3、CTLA-4)陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組(P值均<0.05)，但經(jīng)IL-33刺激后兩組CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、LAG-3和CTLA-4陽性細(xì)胞的比例與無IL-33刺激比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。經(jīng)IL-33刺激后HCC組CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、LAG-3、CTLA-4陽性細(xì)胞比例亦顯著高于對照組(P值均<0.05)(表3)。

注：a,HCC組； b，對照組。圖1 CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞典型流式分析圖

圖2 CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞與IL-33、ST2水平相關(guān)性分析

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組IL-33和ST2水平比較

選擇11例HLA-A02限制性HCC患者和6例HLA-A02限制性對照者的CD8+T淋巴細(xì)胞，IL-33刺激培養(yǎng)后與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)。在無IL-33刺激的情況下，HCC組CD8+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡比例、IFNγ和TNFα分泌均低于對照組(P值均<0.05)。重組IL-33刺激后兩組CD8+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡比例、IFNγ和TNFα分泌均顯著升高(P值均<0.05)(表4)。

表3 兩組無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激后CD8+T淋巴細(xì)胞增殖、毒性分子分泌和免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)的比較

圖3 兩組CD8+T淋巴細(xì)胞無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激后PD-1、LAG-3和CTLA-4表達(dá)的典型流式分析圖

表4 無IL-33刺激和經(jīng)IL-33刺激后CD8+T淋巴細(xì)胞殺傷功能比較

3 討論

在組織損傷過程中，IL-33可作為一種警戒分子釋放至組織和外周血中，通過ST2受體介導(dǎo)的信號通路活化固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的多種免疫細(xì)胞，在多種疾病中發(fā)揮多能性效應(yīng)[9]。但I(xiàn)L-33和ST2在肝臟疾病中的表達(dá)水平和功能在不同研究中卻存在差異性結(jié)果。慢性乙型肝炎患者血清IL-33水平顯著升高，與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，與ALT水平呈正相關(guān)，可能抑制HBV復(fù)制[10]。肝臟浸潤免疫細(xì)胞中的IL-33/ST2介導(dǎo)的信號通路可增加藥物性肝損傷誘導(dǎo)的肝臟炎癥[11]，通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成促進(jìn)肝臟炎癥損傷[12]，促進(jìn)HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者單核細(xì)胞的炎癥風(fēng)暴效應(yīng)[13]。但新近的研究[14]發(fā)現(xiàn)，IL-33可緩解Poly I∶C和刀豆素A誘導(dǎo)急性肝炎所致的肝臟炎癥損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿IL-33和PBMC中IL-33 mRNA水平均顯著降低，這與在HCC組織中IL-33的表達(dá)較癌旁組織中降低的研究結(jié)果一致[15]。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，無論是可溶型ST2還是PBMC中的ST2 mRNA水平在HCC患者和健康對照者之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HCC患者IL-33受體的水平和活性可能未受影響，HCC免疫發(fā)病過程中可能通過影響IL-33水平誘導(dǎo)機(jī)體免疫麻痹或功能衰竭。

在病理學(xué)狀態(tài)下，IL-33可通過抑制Toll樣受體介導(dǎo)的固有免疫信號通路[16]、抑制IL-17受體信號通路介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答[17]、增加IFNγ分泌[18]、促進(jìn)中性粒細(xì)胞向感染部位的募集浸潤[19]等多種機(jī)制改善疾病嚴(yán)重程度。但也有研究[20]發(fā)現(xiàn)，IL-33可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群的增殖和活化，促進(jìn)疾病誘導(dǎo)的長期免疫抑制。但有關(guān)IL-33對HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用罕見相關(guān)報(bào)道。在HCC和結(jié)腸癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，IL-33可在組織局部發(fā)揮作用，通過增強(qiáng)效應(yīng)性CD8+T淋巴細(xì)胞向腫瘤組織浸潤，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能[4,21]。而在營養(yǎng)缺乏和鼠嗜血細(xì)胞綜合征中，IL-33可通過誘導(dǎo)IFNγ分泌調(diào)控CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷功能顯著降低，分泌穿孔素、顆粒酶B等毒性分子的水平下降，而多種免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)水平升高，說明HCC患者中存在CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭。重組IL-33可顯著增強(qiáng)HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的毒性作用，但I(xiàn)L-33并不影響CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖以及免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，但穿孔素、顆粒酶B的分泌顯著升高，提示IL-33主要通過促進(jìn)穿孔素-顆粒酶B途徑增強(qiáng)HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞活性。但由于新近的研究[24-25]發(fā)現(xiàn)IL-33可通過ST2信號通過活化JNK通路誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境重塑，促進(jìn)HCC腫瘤生長。因此，IL-33在HCC發(fā)病中的作用仍需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時，雖然IL-33可促進(jìn)HCC組和對照組CD8+T淋巴細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B。但I(xiàn)L-33是否直接參與穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)調(diào)控仍不清楚，后續(xù)研究中將對IL-33對穿孔素、顆粒酶B表達(dá)啟動子區(qū)域的活性影響進(jìn)行分析，評估IL-33是否直接調(diào)控者兩種分子的表達(dá)。

總之，HCC患者外周血IL-33水平降低。外源性IL-33可通過促進(jìn)穿孔素-顆粒酶B信號通路增強(qiáng)HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞殺傷活性，IL-33可能成為HCC治療新的靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王海鵬、李東輝參與研究數(shù)據(jù)的分析解釋，并起草文章；劉屹參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；沈光輝對研究的思路或設(shè)計(jì)有關(guān)鍵貢獻(xiàn)，并參與修改文章。