高芫超，肖愛波，王 成，王天琪，于 冰，許云賀，張莉力

（錦州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

水開菲爾粒，由胞外多糖組成，是由乳酸菌、醋酸菌等共生微生物組成的穩(wěn)定菌落，被限制在多醣體和蛋白質(zhì)基質(zhì)中，含具有保健功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。水開菲爾，也叫作中國菌菇、緹比水晶和天山雪蓮等，它是由有機(jī)糖溶液和水開菲爾粒自然發(fā)酵而成的一種發(fā)酵飲料，含多種益生菌。水開菲爾中微生物種類很多，主要含乳酸菌、醋酸菌和酵母菌，它們是由多種細(xì)菌和真菌組成的共生菌系[1]，在細(xì)菌組成中能觀察到乳酸菌的顯著控制[2]。在水開菲爾發(fā)酵過程中，水開菲爾粒會(huì)“消化”掉糖，制作出富含益生性乳酸菌的水開菲爾[3]。水開菲爾中含多種酶，能水解多糖，產(chǎn)生果香。其發(fā)酵劑水開菲爾粒經(jīng)發(fā)酵后，會(huì)得到粗纖維等不溶性沉淀成分，這些成分可以用于制作膳食纖維[4-5]。若經(jīng)常喝水開菲爾，乳酸菌可以在人體內(nèi)存活并生長繁殖，水開菲爾的保健功能包括：促進(jìn)消化、增強(qiáng)肝臟功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、幫助減肥[1-2]。益生菌若想成功定植并作用于胃腸道，需要能夠適應(yīng)胃腸道的低 pH及高滲透壓的膽鹽環(huán)境[6]。因此，篩選耐酸、耐膽鹽的益生菌株具有重要研究意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，國內(nèi)外對(duì)水開菲爾的研究包括水開菲爾粒發(fā)酵時(shí)的微生物菌落動(dòng)力學(xué)和代謝組學(xué)，研究表明水開菲爾發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌是乳酸菌，但是水開菲爾形成穩(wěn)定結(jié)合體的分子背景尚不清楚，細(xì)菌區(qū)系的綜合組成也尚未科學(xué)界定[7]。近年來，公眾普遍開始關(guān)注食品營養(yǎng)及保健功效，以牛奶為基礎(chǔ)的奶開菲爾現(xiàn)已被廣泛研究并應(yīng)用于各種發(fā)酵酸奶、益生性乳酸菌飲料中，可作為良好益生菌來源，具有許多潛在的健康益處。然而目前水開菲爾只限制于家庭小作坊式內(nèi)部生產(chǎn)，其未得到廣泛使用、未能投入工業(yè)化生產(chǎn)，主要是因?yàn)槿狈Πl(fā)酵水開菲爾的菌種。

所以，本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)法，分析水開菲爾和水開菲爾粒的細(xì)菌區(qū)系及優(yōu)勢(shì)菌屬。然后以耐酸、耐膽鹽能力做指標(biāo)，從中篩選出具有潛在益生性的菌株。本研究為水開菲爾工業(yè)發(fā)酵提供備選菌株以及為水開菲爾產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水開菲爾、水開菲爾粒：湛江市非歌食品店；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋有限公司；細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒：沈陽立信生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

壓力蒸汽滅菌鍋（DGL-50B）、紫外可見分光光度計(jì)（752N）：常州鴻運(yùn)實(shí)驗(yàn)儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱（303-4B）：浙江尚誠儀器廠；超凈工作臺(tái)（JB-VS-1300）：上海力辰儀器廠；精密 pH 計(jì)（PHS-25）、電子分析天平（M4-AL204）：上海越平有限公司；生物顯微鏡（BM-500T）：福建睿鴻光電科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量

對(duì)水開菲爾和水開菲爾粒中的細(xì)菌和乳酸菌計(jì)數(shù)，細(xì)菌參照 GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，乳酸菌參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，每種樣品做三次平行實(shí)驗(yàn)，記錄結(jié)果。

1.3.2 高通量測(cè)序分析細(xì)菌區(qū)系

主要步驟包括：對(duì)水開菲爾、水開菲爾粒中總DNA提取和16SrDNA的V3-V4可變區(qū)PCR擴(kuò)增，利用的擴(kuò)增引物為正向引物 520F: 5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′，反向引物 802R: 5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′，然后檢測(cè)擴(kuò)增序列，將合格序列進(jìn)行文庫擴(kuò)建并上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為NovaSeq 6000[8]。得到高通量測(cè)序結(jié)果后，去除原始序列中的Barcode和引物序列，再拼接各樣本序列獲得Raw Tags，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾處理，去除不合格序列，用UCHIME軟件識(shí)別并去除嵌合序列，最終獲得有效數(shù)據(jù)[9]。選用Greengenes數(shù)據(jù)庫（Release 13.8，http://greengenes.secondgenome.com/）進(jìn)行注釋。

1.3.3 ASV聚類及物種組成分析

用Uparse軟件對(duì)全部Effective Tags做ASVs聚類，參照相似性為100%，出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列，利用分類數(shù)據(jù)庫分析其物種注釋，得到從門至屬的分類學(xué)信息，在門和屬水平上統(tǒng)計(jì)樣品的物種組成。

1.3.4 潛在益生性乳酸菌的篩選

對(duì)水開菲爾和水開菲爾粒取樣后進(jìn)行梯度稀釋，取 10-5、10-6、10-7、10-8四個(gè)梯度各 1 mL用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行傾注，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，挑取微白色、呈圓形或梭形的菌落，劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 48～72 h，劃線2～3次，觀察其個(gè)體形態(tài)，直至確定是單菌落后編號(hào)[10]。

1.3.4.1 初篩 編號(hào)菌株進(jìn)行 H2O2酶及革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，初步篩選出H2O2酶陰性及革蘭氏染色陽性的菌株，對(duì)符合上述條件的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4.2 復(fù)篩 以菌株的耐酸性，膽鹽耐受力作為菌株的潛在益生性篩選指標(biāo)[11-13]。將初篩所得菌株接種至 MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h活化菌株，用于接種耐酸性和膽鹽耐受力實(shí)驗(yàn)。

耐酸性：活化初篩所得菌株，用鹽酸調(diào)節(jié)MRS肉湯培養(yǎng)基的pH值至3.0，4.0，5.0，以pH值為6.0的MRS肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照組，分裝于各試管中。接種5%（v/v）菌種至上述試管中，37 ℃培養(yǎng)3 h。以未接種的MRS肉湯培養(yǎng)基為參比，在波長 600 nm處利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同培養(yǎng)基中的 OD值，每種樣品做三次平行實(shí)驗(yàn)并取其平均值。按照下列公式計(jì)算菌株的耐酸性：菌株的耐酸性存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組的OD600 nm值/對(duì)照組的OD600 nm值）*100%。上述步驟中耐酸性好的菌株進(jìn)行膽鹽耐受力的測(cè)定。

膽鹽耐受力：參考 Dunne[15]等的方法，配置含0%和0.3%（m/v）牛膽鹽的兩種MRS液體培養(yǎng)基，分裝于各試管。接種 5%（v/v）菌種至上述試管，無牛膽鹽為對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)24 h。在波長 600 nm處利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同培養(yǎng)基中的OD值，每種樣品做三次平行實(shí)驗(yàn)并取其平均值。按照下列公式計(jì)算菌株的膽鹽耐受力：菌株的膽鹽耐受力（%）=（實(shí)驗(yàn)組的OD600 nm值/對(duì)照組的OD600 nm值）*100%

1.3.5 個(gè)體、群體形態(tài)觀察

對(duì)復(fù)篩所得菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，記錄結(jié)果。

1.3.6 生理生化實(shí)驗(yàn)

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中相關(guān)的乳酸菌實(shí)驗(yàn)方法[16]

1.3.7 菌種的16SrDNA鑒定

主要過程包括：提取菌種基因組DNA，PCR擴(kuò)增16SrDNA序列，擴(kuò)增引物為 27F及1492R通用引物。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增及純化后 PCR產(chǎn)物的 DNA序列。測(cè)序所得菌株的16SrDNA序列在NCBI的GeneBank中進(jìn)行比對(duì)，得到相似度最高的菌株序列[17]，通過MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0版本，包括ANOVA單因素方差分析、LSD以及SNK檢驗(yàn)，結(jié)果用x± sem表示。使用Origin繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 水開菲爾和水開菲爾粒中菌落總數(shù)

水開菲爾和水開菲爾粒細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。水開菲爾細(xì)菌總數(shù)為（7.32±0.01 lg） cfu/mL，乳酸菌總數(shù)為（7.08±0.02 lg） cfu/mL；水開菲爾粒細(xì)菌總數(shù)為（8.90±0.05 lg） cfu/mL，乳酸菌總數(shù)為（8.69±0.08 lg） cfu/mL。表明在水開菲爾和水開菲爾粒細(xì)菌區(qū)系中，乳酸菌為兩種樣品的優(yōu)勢(shì)菌，有利于后續(xù)乳酸菌篩選實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。接下來結(jié)合高通量測(cè)序分析水開菲爾和水開菲爾粒的細(xì)菌區(qū)系。

表1 水開菲爾和水開菲爾粒細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Results of bacterial counting of water kefir and water kefir granules cfu/mL

2.2 高通量測(cè)序技術(shù)分析水開菲爾和水開菲爾粒細(xì)菌區(qū)系及優(yōu)勢(shì)菌屬

2.2.1 ASVs聚類

高通量測(cè)序分析水開菲爾和水開菲爾粒細(xì)菌區(qū)系，結(jié)果分別獲得60 151和64 256條有效序列。有效序列按100%一致性進(jìn)行ASVs聚類，出現(xiàn)頻次多的序列為代表性序列，并注釋其物種。其花瓣圖如圖1所示，結(jié)果共得到438個(gè)ASVs，水開菲爾中含 168個(gè) ASVs，水開菲爾粒中含 270個(gè)ASVs，其中兩組共有的 ASVs數(shù)為 93個(gè)，兩組特有的ASVs分別為75和177個(gè)。

圖1 水開菲爾和水開菲爾粒的ASVs聚類Fig.1 ASVs clustering of water kefir and water kefir granules

2.2.2 細(xì)菌α多樣性分析

兩種樣品多樣性指數(shù)分析見表2。如表所示，水開菲爾和水開菲爾粒的覆蓋率均為0.999，表明測(cè)序深度能夠代表樣本的真實(shí)組成[19]。水開菲爾粒的Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)顯著（P＜0.05）高于水開菲爾粒。上述結(jié)果表明，發(fā)酵劑水開菲爾粒的細(xì)菌豐富度及多樣性更高。

表2 兩種樣品多樣性指數(shù)分析Table 2 Diversity index analysis of two samples

2.2.3 細(xì)菌的組成分布

基于門水平的細(xì)菌結(jié)構(gòu)見圖2，在門水平上，水開菲爾中厚壁菌門（79.58%）和變形菌門（19.88%）占總細(xì)菌的99.46%；水開菲爾粒中厚壁菌門（86.67%）和變形菌門（13.32%）占總細(xì)菌的99.99%。結(jié)果表明，水開菲爾與水開菲爾粒細(xì)菌區(qū)系相似，優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門和變形菌門，其中厚壁菌門是最豐富的門，水開菲爾粒中厚壁菌門的含量高于水開菲爾。

圖2 基于門水平的細(xì)菌結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial structure based on gate level

兩種樣品的屬水平結(jié)構(gòu)組成見圖3，水開菲爾中優(yōu)勢(shì)菌屬是乳桿菌屬和醋桿菌屬，相對(duì)含量分別為79.42%、16.38%，上述兩個(gè)屬共占細(xì)菌群體的95.80%；水開菲爾粒中乳桿菌屬（86.64%）和醋桿菌屬（13.32%）占總細(xì)菌的99.96%。結(jié)果表明，水開菲爾與水開菲爾粒細(xì)菌區(qū)系相似，優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬和醋桿菌屬，其中乳桿菌屬是最豐富的屬，且其在水開菲爾粒中含量高于水開菲爾。有實(shí)驗(yàn)表明一些有害菌在pH＜4.5環(huán)境中很難存活，但乳桿菌屬耐酸性較強(qiáng)，能在較低pH值下正常生長繁殖，抑制有害菌生長，占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位[20]。由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，樣品中主要存在的菌為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)篩選所需的乳酸菌，更進(jìn)一步為本實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行奠定理論基礎(chǔ)。

圖3 基于屬水平的細(xì)菌結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial structure based on genus level

2.3 水開菲爾和水開菲爾粒中潛在益生性乳酸菌的篩選

2.3.1 初篩

不同菌株的形態(tài)特征如表3所示，從水開菲爾和水開菲爾粒中共篩選出 30株革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陰性，不含芽孢的菌株。通過油鏡觀察，多數(shù)菌株為桿狀，少數(shù)為球形或卵圓形。

表3 初步篩選的不同菌株的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of different strainspreliminarily screened

2.3.2 復(fù)篩

初篩所得30株菌接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行耐酸性、膽鹽耐受力的測(cè)定。

菌株耐酸性見表4，30株菌株菌體密度隨pH值升高而不斷上升，且存在差異。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，30株菌株均可以生長，但生長情況不同。王俊國[21]、Wang[22]等研究乳酸菌耐酸性，測(cè)定其活菌數(shù)時(shí)得到同樣結(jié)論。一般認(rèn)為，正常人在進(jìn)食后，胃液pH值在3.0上下波動(dòng)，消化時(shí)間需3 h，作為益生性乳酸菌需要有耐酸性而且可以在酸性環(huán)境中生長[23]，所以這 30株菌可以隨食物到達(dá)小腸。其中，cc9菌株的耐酸性最好，cc1、cc4、cc5、cc7、cc8、cc9、cc10、cc12、cc15、cc16、cc17、cc22、cc25、cc26、cc27的菌體密度均比較高，按大小依次排列。上述結(jié)果說明這15株菌株有很好的耐酸性，可以很好的存活在酸度低的環(huán)境中，對(duì)上述15株菌株做進(jìn)一步的篩選。

表4 不同菌株的耐酸性Table 4 Acid tolerance of different strains

菌株膽鹽耐受性：不同菌株的膽鹽耐受能力存在差異[24-25]，一般情況下，體內(nèi)小腸膽鹽濃度范圍是0.03%～0.3%[23]。因此，作為益生性乳酸菌，必須能在0.3%膽鹽濃度環(huán)境中存活并生長。菌株的膽鹽耐受性見表5，同樣培養(yǎng)24 h，15株菌的菌體密度在無膽鹽培養(yǎng)基中很高，在含0.3%膽鹽培養(yǎng)基中均下降。其中，cc1膽鹽耐受性最強(qiáng)，為35.68%，高于郭均[23]等從水開菲爾中分離出的益生性乳酸桿菌，cc1＞cc9＞cc5＞cc22＞cc12＞cc4＞cc8，這7株菌株膽鹽耐受性好，能夠耐受消化道的高膽鹽環(huán)境，順利通過小腸到達(dá)大腸。

表5 不同菌株的膽鹽耐受性Table 5 Bile salt tolerance of different strains

2.4 菌株的生理生化特征

2.4.1 個(gè)體、群體形態(tài)特征

通過油鏡觀察，7株菌株形態(tài)一致，呈桿狀，菌落大小為1～3 mm，形態(tài)呈乳白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑，細(xì)胞分裂后排列方式為鏈狀，革蘭氏染色呈陽性，不含芽孢。

2.4.2 生理生化檢測(cè)

生理生化結(jié)果見表6，其結(jié)果表明，這 7株菌不產(chǎn)吲哚、硫化氫，接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰性，硝酸鹽實(shí)驗(yàn)呈陽性，不運(yùn)動(dòng)，具有一定耐酸耐鹽性，將其初步歸屬為乳桿菌屬。

表6 菌株生理生化特性Table 6 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.5 菌株的16SrDNA鑒定

篩選出7株乳酸菌cc1，cc4，cc5，cc8，cc9，cc12，cc22，其16SrDNA序列長度分別為1 454 bp，1 468 bp，1 457 bp，1 467 bp，1 467 bp，1 450 bp，1 439 bp。將其提交到Genbank經(jīng)BLAST比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖 4，cc1的親緣性與Lactobacillus paracasei(MT613527.1)最接近，cc4的親緣性與LimosiLactobacillus fermentum(MW405853.1)最接近，cc5的親緣性與Lactobacillus harbinensis(MW405854.1)最接近，cc8的親緣性與Lactobacillus fermentum(EU419595.1)最接近，cc9的親緣性與Lactobacillus fermentum(MT611890.1)最接近，cc12的親緣性與Lactobacillus satsumensis(MW405857.1)最接近，cc22的親緣性與Lactobacillus fermentum(MT641196.1)最接近，相似度均＞99%。結(jié)合個(gè)體和群體形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA的分子測(cè)序結(jié)果，初步鑒定cc4、cc8、cc9、cc22為發(fā)酵乳桿菌，cc1為副干酪乳桿菌、cc5為哈爾濱乳桿菌、cc12為紅條乳桿菌，GenBank號(hào)分別為MW405853、MW405855、MW405856、MW405858、MW405852、MW405854、MW405857，分別命名為Lactobacillus fermentumcc4、Lactobacillus fermentumcc8、Lactobacillus fermentumcc9、Lactobacillus fermentumcc22、Lactobacillus paracaseicc1、Lactobacillus harbinensiscc5、Lactobacillus satsumensiscc12。

圖4 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)法，檢測(cè)分析了水開菲爾和其發(fā)酵劑水開菲爾粒兩種樣品的細(xì)菌組成中，優(yōu)勢(shì)門均為厚壁菌門和變形菌門，優(yōu)勢(shì)屬均為乳桿菌屬和醋桿菌屬。為尋找具有潛在益生性的菌株，以耐酸性和膽鹽耐受力為指標(biāo)，從自然發(fā)酵水開菲爾和水開菲爾粒中篩選出 7株乳酸菌。經(jīng)鑒定，4株為發(fā)酵乳桿菌：L. fermentumcc4、L. fermentumcc8、L. fermentumcc9、L. fermentumcc22，1株為副干酪乳桿菌：L. paracaseicc1，1株為哈爾濱乳桿菌：L.harbinensiscc5，1株為紅條乳桿菌：L. satsumensiscc12。這些菌株可作為水開菲爾工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的備選菌株。