李本金 王榮波 劉裴清 鄧麗霞 石茗月 李慧斌 陳慶河

摘要

為明確福建省部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)，2017年-2019年在龍海市、福安市、霞浦縣共分離獲得96株馬鈴薯晚疫病菌。采用對峙培養(yǎng)法、鑒別寄主法和PCRRFLP法對這些菌株的交配型、生理小種及線粒體DNA （mtDNA）單倍型進(jìn)行分析。交配型測定結(jié)果顯示，除了福建省福安市有5株（5.21%）為A1交配型外，其余91株（94.79%）均為自育型，未發(fā)現(xiàn)A2交配型及A1A2型菌株。從96個菌株中檢測出16個生理小種類型，龍海市和福安市的優(yōu)勢生理小種均是可克服11個顯性抗病單基因的1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11，霞浦縣的優(yōu)勢生理小種為1.2.3.4.5.6.7.8.10。供試菌株均至少含有6個毒性基因。mtDNA單倍型共檢測出3種類型，其中55個菌株（龍海市22株、福安市8株、霞浦縣25株）為Ⅰa型，占57.29%，32個菌株（龍海市2株、福安市25株、霞浦縣5株）為Ⅱa型，占33.33%，9個菌株（福安市7株、霞浦縣2株）為Ⅱb型，占9.37%。研究結(jié)果表明，福建省馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性日趨復(fù)雜。

??關(guān)鍵詞

馬鈴薯晚疫病菌;交配型;生理小種;mtDNA單倍型

中圖分類號：

S435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020645

Population structure of Phytophthora infestans isolates collected from a part of potato producing areas in Fujian province

LI Benjin1，WANG Rongbo1，LIU Peiqing1，DENG Lixia1，SHI Mingyue1，LI Huibin1，CHEN Qinghe1，2*

（1. Fujian Key Laboratory for Monitoring and Integrated Management of Crop Pests， Institute of

Plant Protection， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou350013， China; 2. Key

Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of

Education， College of Plant Protection， Hainan University， Haikou570228， China）

Abstract

To clarify the population structure of Phytophthora infestans in a part of potato producing areas in Fujian province， a total of 96 P.infestans isolates were collected from Longhai city， Fu’an city and Xiapu county of Fujian province from 2017 to 2019， and the mating type， physiological race and mitochondrial DNA haplotype were identified based on plate confrontation culture， host identification and PCRRFLP. The results showed that 91 out of the 96 P. infestans isolates were selffertile， accounting for 94.79%; five isolates collected from Fu’an belonged to A1 mating type， accounting for 5.21%， while A2 mating type and A1A2 type were not detected in this study.? A total of 16 different physiological races were detected. The race 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11? was the dominant species in Longhai and Fu’an cities， and the race 1.2.3.4.5.6.7.8.10 was the dominant species in Xiapu county. All of the isolates contained at least six virulence genes. Three mtDNA haplotypes （Ⅰa， Ⅱa andⅡb） were detected in this study， among which，Ⅰa type included 55 isolates （22 isolates in Longhai city， 8? isolates in Fu’an city and 25? isolates in Xiapu county）， accounting for 57.29%， Ⅱa type included 32 isolates （2? isolates in Longhai city， 25? isolates in Fu’an city and 5? isolates in Xiapu county）， accounting for 33.33%， andⅡb type included 9 isolates （7? isolates in Fu’an city and 2? isolates in Xiapu county）， accounting for 9.37%. The results indicated that the composition of P.infestans populations was getting more and more complex in Fujian province.

Key words

Phytophthora infestans;mating type;physiological race;mitochondrial DNA haplotype

馬鈴薯是繼水稻、小麥、玉米之后的世界第四大糧食作物，我國已成馬鈴薯生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國，近年來種植面積更是呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。由致病疫霉Phytophthora infestans引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，一般年份減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[1]。該病在世界各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和流行，我國每年因晚疫病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元[2]。

馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)的組成與變異直接影響著病害的發(fā)生與流行，了解晚疫病菌群體特征及變異特點(diǎn)是控制晚疫病危害的必要前提。交配型是馬鈴薯晚疫病菌重要的群體結(jié)構(gòu)特征之一，晚疫病菌存在A1、A2兩種交配型，兩者可通過異宗配合進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生卵孢子，而自育型菌株單獨(dú)培養(yǎng)便可產(chǎn)生卵孢子。卵孢子的抗逆性強(qiáng)，能在土壤中越冬并成為翌年初侵染源，而且在有性生殖過程中會發(fā)生基因重組，有可能會產(chǎn)生致病力更強(qiáng)的后代群體。生理小種是晚疫病菌遺傳多樣性的重要表現(xiàn)型，1953年，Black等[3]提出了馬鈴薯晚疫病菌生理小種命名后，各國學(xué)者相繼報道了馬鈴薯晚疫病菌生理小種組成，且發(fā)現(xiàn)小種類型不斷趨于復(fù)雜化，復(fù)合小種類型已占主導(dǎo)地位。近年來，能克服11個主效抗性基因的超級小種在各省普遍出現(xiàn)，甚至已成為優(yōu)勢小種[4-7]。線粒體DNA單倍型因其結(jié)構(gòu)簡單，進(jìn)化速度快，且為單親遺傳，已被廣泛用于馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性分析[8]。Griffith等利用 PCRRFLP方法將線粒體單倍型分為Ⅰa，Ⅰb，Ⅱa，Ⅱb 4種類型[9]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)這4種單倍型在我國不同地區(qū)的分布情況不盡相同[5，10]。

近年來，隨著種薯的頻繁調(diào)運(yùn)，病原菌傳播速度加快，馬鈴薯晚疫病所造成的危害日趨嚴(yán)重，對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展構(gòu)成巨大威脅。因此，及時監(jiān)測馬鈴薯晚疫病菌群體特征及動態(tài)變化對該病害綜合治理具有重要的意義。近幾年對福建省晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究鮮有報道。本研究對福建省部分馬鈴薯主栽區(qū)晚疫病菌的交配型、生理小種及線粒體DNA單倍型進(jìn)行分析，旨在明確馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)組成及分布，從而為抗病品種選育和馬鈴薯晚疫病的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：2017年-2019年在福建省龍海市、福安市、霞浦縣馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集具有典型晚疫病癥狀的病葉，按鄭小波[11]的方法進(jìn)行病原菌分離純化，共獲得96株馬鈴薯晚疫病菌。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：測定晚疫病菌交配型的A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株由美國康奈爾大學(xué)Fry W E博士惠贈。

鑒別寄主：從黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引入一套完整的馬鈴薯晚疫病菌生理小種鑒別寄主，由11個含主效抗病單基因（R1～R11）的抗病品種和1個無抗病基因的感病品種（r）組成，均為無菌保存的試管苗。

1.2交配型測定

采用對峙培養(yǎng)方法測定各菌株的交配型。將待測菌株與A1、A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種至黑麥培養(yǎng)基上， 在18～20℃黑暗條件下培養(yǎng)10～15 d后，在新鮮菌落邊緣打取直徑7 mm菌餅，轉(zhuǎn)移至新鮮黑麥培養(yǎng)基上，待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株以2.5 cm的間距對峙培養(yǎng)，另設(shè)待測菌株單獨(dú)培養(yǎng)，在18～20℃黑暗條件下培養(yǎng)15～20 d后，在顯微鏡下觀察各待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙培養(yǎng)的菌落交界處及單獨(dú)培養(yǎng)的菌落是否產(chǎn)生卵孢子。若待測菌株僅與A1標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生卵孢子則為A2交配型，僅與A2標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生卵孢子則為A1交配型，與A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株均產(chǎn)生卵孢子，但單獨(dú)培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)卵孢子為A1A2型，單獨(dú)培養(yǎng)即能產(chǎn)生卵孢子的為自育型。

1.3生理小種測定

1.3.1孢子懸浮液的制備

晚疫病菌菌株在黑麥培養(yǎng)基上18～20℃黑暗培養(yǎng)1～2周后，移至經(jīng)表面消毒的不含主效抗病基因的新鮮薯片（‘費(fèi)爾瑞它’）上，使其產(chǎn)生孢子囊并恢復(fù)致病力。7～10 d后，從薯片上刮下菌絲至裝有滅菌水的離心管中，振蕩洗下孢子囊，過濾后用血球計數(shù)板計數(shù)，將懸浮液中的孢子囊數(shù)調(diào)至約5×104個/mL，4℃冰箱內(nèi)靜置2～3 h，低溫刺激游動孢子釋放后用于接種。

1.3.2鑒別寄主的種植

鑒別寄主（試管苗）在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右，移栽至以蛭石為基質(zhì)的花盆中，澆以MS營養(yǎng)液，在溫室18～25℃條件下生長6～8周后備用。

1.3.3人工接種鑒定生理小種

采用離體葉片接種法鑒定晚疫病菌生理小種。取鑒別寄主植株中部復(fù)葉的小葉片（生育期基本一致），用滅菌水將葉面沖洗干凈，陰干后背面朝上放置在裝有無菌的1.5%水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，用微量移液器吸取20 μL游動孢子懸浮液接種于葉脈側(cè)面，每個菌株接種1套鑒別寄主，每個鑒別寄主接種4片葉片，每處理3次重復(fù)。接種后于18～20℃黑暗培養(yǎng)過夜，第2天將葉片翻轉(zhuǎn)，置于18～20℃光照培養(yǎng)箱中（L∥D=16 h∥8 h）進(jìn) 行保濕（濕度不低于95%）培養(yǎng)，第7～10 天觀察接種部位是否出現(xiàn)癥狀。接種部位形成病斑并產(chǎn)生菌絲和孢子囊的即為感病型，接種部位無癥狀或只有壞死斑但無孢子囊產(chǎn)生的即為抗病型。每個菌株至少使4片葉中的3片葉發(fā)病，才稱其具有毒力，否則要繼續(xù)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.4生理小種的確定

根據(jù)馬鈴薯與晚疫病菌的互作關(guān)系符合基因?qū)驅(qū)W說，確定菌株對所有鑒別寄主的抗病/感病情況后，根據(jù)Black等[3]提出的馬鈴薯晚疫病菌生理小種國際命名方案， 確定生理小種類型。根據(jù)晚疫病菌在 12個鑒別寄主上引起的反應(yīng)，相應(yīng)地命名為小種 0;1;2;……及小種1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11。所有小種都能侵染不具任何抗病基因的感病品種（r）。

1.4mtDNA單倍型分析

1.4.1基因組DNA提取

供試晚疫病菌菌絲體培養(yǎng)和收集參考連延浩等的方法[12]。采用植物DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，并用TE緩沖液稀釋至50 ng/μL待用。

1.4.2引物的選擇

參照Griffith等[9]的方法選擇2對引物（F2： 5′TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT 3′、R2： 5′TTACG GCGGTTTAGCA CATACA 3′; F4：? 5′TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT 3′、? R4： 5′CCGATACCGATACCAGCACCAA3′） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，產(chǎn)物分別為P2、P4，片段長度分別為1 070 bp和964 bp。

1.4.3PCR擴(kuò)增

以晚疫病菌DNA為模板，分別用F2/R2 和F4/R4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL： 10×PCR buffer （Mg2+free） 2.5 μL，25 mmol/L MgC12 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 2.0 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，用無菌超純水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性90 s;94℃變性40 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán);72℃延伸90 s。擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物用含0.5 μg/mL EB的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

1.4.4mtDNA單倍型分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物P2和P4分別用限制性內(nèi)切酶MspⅠ和EcoRⅠ酶切。酶切體系20 μL： 10×PCR Buffer 2.0 μL，BSA 0.2 μL，MspⅠ或EcoRⅠ 0.5 μL，產(chǎn)物P2或P4 15 μL，用無菌超純水補(bǔ)足20 μL。37℃水浴消化過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，再根據(jù)P2產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切和P4產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后的 結(jié)果對晚疫病菌線粒體 DNA單倍型進(jìn)行分析。被測樣本的P2產(chǎn)物被 MspⅠ酶切后，Ⅰa mtDNA單倍型可產(chǎn)生350、720 bp 2個片段，Ⅰb mtDNA單倍型可產(chǎn)生79、350、641 bp 3個片段，Ⅱa mtDNA單倍型可產(chǎn)生147、203、720 bp 3個片段，Ⅱb mtDNA單倍型可產(chǎn)生350、720 bp 2個片段;被測樣本的P4產(chǎn)物被EcoRⅠ酶切后，Ⅰa mtDNA單倍型可產(chǎn)生209、361、394 bp 3個片段，Ⅰb mtDNA單倍型可產(chǎn)生209、361、394 bp 3個片段，Ⅱa mtDNA單倍型可產(chǎn)生361、603 bp 2個片段，Ⅱb mtDNA單倍型可產(chǎn)生361、603 bp 2個片段。

2結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯晚疫病菌的交配型組成、發(fā)生頻率及地理分布

對采自福建省的96株馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行交配型測定，結(jié)果（表1）顯示，龍海市24株、福安市40株中的35株、霞浦縣32株為自育型菌株，即不需交配即能產(chǎn)生卵孢子，占供試菌株94.79%，福安市有5株為A1交配型，占供試菌株5.21%，供試群體中未發(fā)現(xiàn)A2交配型和A1A2型菌株。

2.2馬鈴薯晚疫病菌毒性基因鑒定及生理小種組成分析

利用 11個含主效抗病單基因及 1個不含抗病基因的一套鑒別寄主，采用離體葉片接種法測定馬鈴薯晚疫病菌的生理小種，結(jié)果（圖1）顯示：福建省部分產(chǎn)區(qū)晚疫病菌可以克服11個已知的抗性基因R1～R11，但晚疫病菌群體對各個抗性基因的毒性頻率存在差異，對R6、R8的毒性頻率均為100%，其次為R4、R1、R7、R10，毒性頻率分別為98.96%、97.92%、97.92%、96.88%，對R2、R3、R5的毒性頻率也較高，分別為88.54%、88.54%、82.29%，對 R9、R11的毒性頻率較低，分別為39.58%、36.46%。

從表2可以看出，96個菌株中共檢測出16個生理小種類型，每種類型含有6～11個毒性基因，其中龍海市以生理小種1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11發(fā)生最普遍，出現(xiàn)頻率為8.33%， 其次為1.3.4.5.6.7.8.10和1.2.3.4.6.7.8.10，出現(xiàn)頻率均為4.12%;福安市以生理小種1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11 發(fā)生最普遍，出現(xiàn)頻率為12.50%，其次為1.3.4.5.6.7.8.10 和1.2.4.5.6.7.8.10，出現(xiàn)頻率分別為7.29%和6.25%;霞浦縣以生理小種1.2.3.4.5.6.7.8.10 發(fā)生最普遍，出現(xiàn)頻率為16.67%，其次為1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11和1.2.3.4.6.7.8.10，出現(xiàn)頻率均為5.21%;其他小種的出現(xiàn)頻率在1.04%～3.13%。該結(jié)果表明福建省部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)晚疫病菌不僅生理小種組成復(fù)雜，而且其毒性基因構(gòu)成也相當(dāng)復(fù)雜。

2.3馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型分析

2.3.1馬鈴薯晚疫病菌mt DNA的PCR擴(kuò)增

使用F2/R2和F4/R4 2對引物分別對96株馬鈴薯晚疫病菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，P2產(chǎn)物為1 070 bp，P4產(chǎn)物為964 bp。

2.3.2馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型分析

所測的96株晚疫病菌中，共發(fā)現(xiàn)Ⅰa、Ⅱa、Ⅱb 3種mt DNA單倍型（部分結(jié)果見圖3），其中龍海市，Ⅰa型22株（占總株數(shù)22.92%，下同），Ⅱa型2株（2.08%），福安市，Ⅰa型8株（8.33%），Ⅱa型25株（26.04%），Ⅱb型7株（7.29%），霞浦縣，Ⅰa型25株（26.04%），Ⅱa型5株（5.21%），Ⅱb型2株（2.08%）。在所有菌株中均未檢測到Ⅰb單倍型（表3）。龍海市和霞浦縣優(yōu)勢mtDNA單倍型均為Ⅰa型，而福安市則為Ⅱa型。

3討論

20 世紀(jì)80 年代后在英國、美國、日本、德國、荷蘭、匈牙利、俄羅斯、瑞士、挪威等國檢測到少量晚疫病菌自育型菌株[10]。中國自20世紀(jì)60 年代發(fā)現(xiàn)自育型晚疫病菌株后[13]，四川、內(nèi)蒙古、甘肅等省也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了自育型菌株[14- 18]。2001年-2007年福建省11個縣市187株晚疫病菌交配型鑒定結(jié)果顯示，僅在2006年發(fā)現(xiàn)1株自育型菌株[19]。本研究測定了2017年-2019年采自福建省龍海市、福安市、霞浦縣的96株晚疫病菌交配型，結(jié)果顯示，除了來自福安市5個菌株為A1交配型外，其余91株均為自育型，可見福建省晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化。該結(jié)果與方治國[20] 2011年采自福建省218株晚疫病菌鑒定結(jié)果全部為自育型菌株相似。

本試驗(yàn)從2017年-2019年采自福建省的96個菌株中測定出16個生理小種類型， 每種類型含有6～11個毒性基因，全譜型小種1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11 已成為福安市和龍海市的優(yōu)勢小種類型。與李本金等[19] 2008年報道的福建省馬鈴薯晚疫病菌生理小種檢測結(jié)果相比，此次檢測到毒性基因組合更加復(fù)雜，“超級生理小種”頻繁出現(xiàn)并成為優(yōu)勢小種，這種趨勢與國內(nèi)外相關(guān)報道[4，21- 23] 結(jié)果一致，其原因可能與福建省大面積栽培含有主效抗病基因的馬鈴薯品種、各地頻繁的引種調(diào)種以及大量出現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌自育型菌株有關(guān)。福建省馬鈴薯晚疫病菌生理小種組成的復(fù)雜性給育種工作帶來很大難度，因此在挖掘新的抗原和選育抗性品種的同時，應(yīng)選擇無病種薯，并且密切關(guān)注晚疫病菌生理小種變化情況。

國外對晚疫病菌群體mtDNA單倍型多態(tài)性的研究認(rèn)為，Ⅰb類型代表晚疫病菌在第二次全球遷移之前形成的“舊”群體，Ⅰa、Ⅱa、Ⅱb 3種類型代表晚疫病菌在第二次全球遷移之后形成的“新”群體[24- 25]。 本文發(fā)現(xiàn)2017年后福建馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型發(fā)生明顯變化，由之前報道 的Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb型[26]演變成了Ⅰa、Ⅱa、Ⅱb型，且Ⅱb為優(yōu)勢 mtDNA單倍型演變成了Ⅰa或Ⅱa為優(yōu)勢mtDNA單倍型， 其原因可能與福建省每年都從北方和周邊主產(chǎn)區(qū)調(diào)入大量的種薯有關(guān)，在調(diào)入種薯的同時，不同線粒體單倍型的晚疫病菌也跟隨著種薯被帶進(jìn)福建不同產(chǎn)區(qū)。本研究未檢測 到Ⅰb 單倍型，該結(jié)果與福建、云南、青海、黑龍江等省[8，10，12，27]的報道一致，說明被檢測地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌均為“新”群體，從而導(dǎo)致馬鈴薯晚疫病菌遺傳結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。因此，除了加快抗性品種選育的進(jìn)程外，還需要持續(xù)對晚疫病菌群體演變趨勢進(jìn)行監(jiān)測，以便能準(zhǔn)確預(yù)測晚疫病的危害和流行趨勢，科學(xué)有效地指導(dǎo)病害的合理控制。

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收稿日期：2020 -12 -03修訂日期：2021 -01- 15

基金項(xiàng)目：

福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2019R10244）;閩寧合作項(xiàng)目（DWX2018035）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXTD2021002-1）

* 通信作者

Email：chenqh@faas.cn