蘇培淵 楊 清 付 兵 陳岳威 徐浩然 黃文輝 （成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤，具有較高發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)生可能與患者生活習(xí)慣、遺傳史和基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)［1］。從基因表達(dá)情況分析EC發(fā)生發(fā)展是目前臨床研究熱點(diǎn)。自噬又稱“Ⅱ型程序性死亡”，是真核生物特有的一種重要生理活動(dòng)，普遍存在于正常細(xì)胞和病態(tài)細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受損時(shí)，能夠降解受損、變性和失去功能的細(xì)胞器和蛋白，清除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞再循環(huán)和再利用。當(dāng)自噬水平過(guò)高時(shí)，會(huì)因過(guò)度降解胞內(nèi)物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［2］。隨著酵母模型建立和基因技術(shù)發(fā)展，人們對(duì)自噬及其分子機(jī)制的了解逐步深入，認(rèn)識(shí)到自噬與人類多種疾病密切相關(guān)，尤其是惡性腫瘤。自噬與腫瘤的關(guān)系復(fù)雜，使其成為腫瘤治療靶點(diǎn)［3］。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，高度保守，可與靶基因mRNA的3'UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，影響相應(yīng)蛋白及信號(hào)分子表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤中表達(dá)異常并發(fā)揮促癌或抑癌基因作用，通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等過(guò)程影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，在腫瘤早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及腫瘤治療方面具有重要價(jià)值［5-6］。miR-30a位于染色體 17q23.1區(qū)，在多發(fā)性骨髓瘤、腎癌和EC等組織中表達(dá)較低，發(fā)揮抑癌基因作用［7-9］。目前針對(duì)miR-30a在EC細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的研究較多，自噬在EC細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制研究也備受關(guān)注。但miR-30a、自噬及EC的相互作用研究報(bào)道甚少。因此，本研究擬探討miR-30a通過(guò)靶向調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin-1和ATG5表達(dá)對(duì)EC細(xì)胞自噬及增殖過(guò)程的影響，為臨床EC治療提供方法，為抗腫瘤分子機(jī)制研究奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來(lái)源 收集2016年2月至2017年12月于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除并確診的45例EC患者組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）。收集標(biāo)本于液氮保存。采用醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤大小、TNM分期等信息，其中男性30例、女性15例，中位年齡61歲，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期26例。所有患者均未進(jìn)行放療、化療等治療，患者及家屬知情同意，研究方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019005004）。

1.1.2 主要儀器與試劑 人EC細(xì)胞株Eca-109、正常食管上皮細(xì)胞株HEEC（中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（中國(guó)四季青生物公司）；Beclin-1、ATG5抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；β-actin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（中國(guó)中杉金橋公司）；miR-32amimic、mimic NC（上海吉?jiǎng)P基因公司）；擴(kuò)增引物（上海華大基因公司）；免疫組化S-P試劑盒、BCA試劑盒、ECL顯影劑（中國(guó)碧云天公司）；胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）；IX51倒置顯微鏡（日本Olimpus公司）；DYCZ 425D型雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 采用含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞，待細(xì)胞80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，1×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞密度至60%時(shí)，采用LipofectamineTM3000將miR-30a-mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，體外常規(guī)培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。將Eca-109細(xì)胞分為3組：未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組（control）、轉(zhuǎn)染mimic NC的陰性對(duì)照組（mimic NC組）、轉(zhuǎn)染miR-30a-mimic的干擾組（miR-30a組）。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) TargetScanHuman（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)miR-30a的靶基因，發(fā)現(xiàn)Beclin-1、ATG5可能是miR-30a的靶基因。分別構(gòu)建Beclin-1、ATG5野生型3'UTR載體（pGL3-Beclin-1-3'UTR-WT、pGL3-ATG5-3'UTR-WT）和突變型3'UTR熒光素酶報(bào)告載體（pGL3-Beclin-1-3'UTR-MUT、pGL3-ATG5-3'UTR-MUT）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞接種于6孔板，將兩種質(zhì)粒分別與mimic NC和miR-30a-mimic混合，通過(guò)LipofectamineTM3000分別共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，48 h后收集各組細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物，按試劑盒要求檢測(cè)熒光素酶活性，確定miR-30a與Beclin-1、ATG53'UTR是否結(jié)合。

1.2.3 在線生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析 從GEO基因數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載EC數(shù)據(jù)集GSE112926，為手術(shù)切除的食管組織樣本miRNA芯片數(shù)據(jù)，包括7例正常食管組織、18例食管鱗狀細(xì)胞癌、13例腺狀細(xì)胞癌。分析正常食管組織及EC組織中miR-30a表達(dá)。在線網(wǎng)站 Kmplot（https：//kmplot.com/analy-sis/）評(píng)估GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-30a表達(dá)對(duì)患者生存率的影響。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org/）和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線分析Beclin-1、ATG5在正常食管組織和EC組織中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后的影響。

1.2.4 免疫組化染色檢測(cè)Beclin-1、ATG5表達(dá)將患者組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成3 μm切片，高溫熔蠟，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，高溫水浴下用EDTA緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉2 h，分別滴加Beclin-1、ATG5一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日滴加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，梯度乙醇脫水，風(fēng)干后中性膠封片，光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察并記錄。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Beclin-1、ATG5均分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，雙盲法在每張切片上隨機(jī)觀察5個(gè)視野，以胞質(zhì)或胞膜發(fā)現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志。無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，2～3分為高表達(dá)，0～1分為低表達(dá)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-30a、Beclin-1、ATG5表達(dá) 無(wú)菌收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞及HEEC細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞目的基因表達(dá)，以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算miR-30a、Beclin-1、ATG5相對(duì)表達(dá)。PCR引物序列：U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；Beclin-1 正向引物 5'-TATTGAAACTCCTCGCCAGGA-3'，反 向 引 物5'-GGCATAACGCATCTGGTTTT-3'；ATG5正向引物5'-ATGACAGATGACAAAGATGTGC-3'，反 向引 物5'-TGTGCCTTCATATTCAAACC-3'；miR-30a正向引物5'-TGAGACATTAAAGTGAACCGGA-3'，反向引 物5'-ACGAGCAGGCCACACCCAGCAG-3'。循環(huán)過(guò)程：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及癌細(xì)胞單克隆形成 MTT：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，以1×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，加入MTT溶液37 ℃孵育4 h，離心去上清，加入DMSO溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。單克隆形成：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，以1×103個(gè)/孔接種于6孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每周換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，4%多聚甲醛溶液固定15 min，結(jié)晶紫染色，觀察菌落形成情況并拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 胰酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔，當(dāng)細(xì)胞呈單壁生長(zhǎng)時(shí)，200 μl移液器槍頭劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并記錄劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察記錄劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。細(xì)胞劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，以細(xì)胞劃痕愈合率表示細(xì)胞遷移率。

1.2.8 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell小室平板平鋪一層Matrigel基質(zhì)膠（約50 μl），將無(wú)血清培養(yǎng)基中的各組單細(xì)胞懸液加至上室（遷移實(shí)驗(yàn)不鋪膠，侵襲實(shí)驗(yàn)鋪Matrigel膠），小室下室平鋪含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，PBS清洗，甲醛固定，蘇木精染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)Beclin-1、ATG5、LC3 Ⅱ、p62蛋白表達(dá) 收集各組EC細(xì)胞，PBS洗滌，采用細(xì)胞裂解液制成懸浮液，低溫超聲破碎細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BSA試劑盒測(cè)定蛋白含量，各組取等量蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST稀釋的5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)一抗（1∶2 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶10 000）孵育2 h，ECL顯色，數(shù)字成像儀拍照，Quantity one軟件分析條帶灰度，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.10 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬泡形成 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化并制成細(xì)胞懸液，1×106個(gè)/孔接種于6孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，于4%戊二醛4 ℃固定1 h，常規(guī)電鏡固定、脫水、包埋，制成超薄切片，H-7500透射電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) TargetScan-Human在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1A）顯示，miR-30a與Beclin-1、ATG5基因均存在結(jié)合位點(diǎn)，分別結(jié)合于Beclin-1基因第240～247核苷酸位置、ATG5基因第707～714核苷酸位置。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果（圖1B、C）顯示，轉(zhuǎn)染miR-30a后，與control組相比，野生型Beclin-1、ATG5熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而突變型Beclin-1、ATG5熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明miR-30a可明顯調(diào)控帶有Beclin-1、ATG5基因片段3'UTR的基因表達(dá)，Beclin-1、ATG5是miR-30a的靶基因。

圖1 miR-30a靶向調(diào)控Beclin-1、ATG5基因及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)Fig.1 miR-30a targeting regulates Beclin-1 and ATG5 genes and dual luciferase experiment

2.2 在線生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 數(shù)據(jù)集GSE112926標(biāo)本分析結(jié)果（圖2A）顯示，與正常食管組織相比，EC中miR-30a表達(dá)升高；Kmplot分析顯示，miR-30a低表達(dá)的EC患者生存期明顯長(zhǎng)于高低表達(dá)患者（圖2B），說(shuō)明miR-30a在EC中的表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，在EC中具有潛在研究?jī)r(jià)值。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)（圖2C）顯示，食管組織樣本經(jīng)免疫組化后，與正常組織相比，EC組織Beclin-1、ATG5表達(dá)明顯升高。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx項(xiàng)目中的EC組織Beclin-1、ATG5表達(dá)，表明EC組織Beclin-1、ATG5表達(dá)明顯高于正常組織（圖2D），且Beclin-1、ATG5表達(dá)越高，患者生存期越短（P＜0.05，圖2E），說(shuō)明Beclin-1、ATG5在EC中的表達(dá)具有研究意義。

圖2 在線生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析Fig.2 Online biological database analysis

2.3 免疫組化染色檢測(cè)Beclin-1、ATG5表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，Beclin-1、ATG5在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈片狀分布的棕黃色，其陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（圖3）。

圖3 EC及癌旁組織Beclin-1、ATG5表達(dá)（×400）Fig.3 Beclin-1 and ATG5 expressions in EC and adjacent tissues （×400）

2.4 Beclin-1、ATG5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 為驗(yàn)證Beclin-1、ATG5在EC發(fā)生發(fā)展中的作用，45例患者按Beclin-1、ATG5表達(dá)分為高表達(dá)組（Beclin-1：18例，ATG5：19例）、低表達(dá)組（Beclin-1：27例，ATG5：26例），結(jié)果顯示，Beclin-1、ATG5表達(dá)與年齡、性別無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)（P＜0.05，表1）。Beclin-1、ATG5表達(dá)越低，TNM分期越晚，腫瘤分化程度越低、浸潤(rùn)程度越高、淋巴結(jié)越易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

表1 EC組織中Beclin-1、ATG5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分性Tab.1 Correlation between expressions of Beclin-1 and ATG5 in EC tissues and clinical pathological parameters of patients

2.5 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞 miR-30a、Beclin-1、ATG5表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常HEEC細(xì)胞相比，Eca-109細(xì)胞miR-30a表達(dá)明顯上升，Beclin-1、ATG5表達(dá)明顯下降（P＜0.05，圖4A）；與control組和mimic NC組相比，miR-30a組Beclin-1、ATG5表達(dá)明顯降低（P＜0.05），而 control組和mimic NC組Beclin-1、ATG5表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05，圖4B）。

圖4 各組細(xì)胞miR-30a、Beclin-1、ATG5表達(dá)Fig.4 miR-30a， Beclin-1， ATG5 expressions of cells in each group

2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖及癌細(xì)胞單克隆染色MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組和mimic NC組相比，miR-30a組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而control組和mimic NC組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5A）。單克隆染色結(jié)果顯示，與control組和mimic NC組相比，miR-30a組細(xì)胞單克隆形成數(shù)顯著增加（P＜0.05），而control組和mimic NC組細(xì)胞單克隆形成數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5B）。

圖5 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖及單克隆形成數(shù)Fig.5 MTT method to detect cell proliferation and number of formed cells by monoclonal in each group

2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與control組和mimic NC組相比，miR-30a組細(xì)胞愈合能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而control組和mimic NC組細(xì)胞愈合能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移Fig.6 Scratch test to determine migration of cells

2.8 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組和mimic NC組相比，miR-30a組細(xì)胞遷移數(shù)和穿過(guò)Matrigel膠細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），而control組和mimic NC組細(xì)胞遷移數(shù)和穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。

圖7 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲Fig.7 Transwell to detect cell migration and invasion of each group

2.9 Western blot檢測(cè)Beclin-1、ATG5、LC3 Ⅱ、p62蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與control組和mimic NC組相比，miR-30a組細(xì)胞Beclin-1、ATG5、LC3 Ⅱ表達(dá)明顯降低，p62表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而control組和mimic NC組相比，細(xì)胞Beclin-1、ATG5、LC3 Ⅱ、p62蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖8）。

圖8 Western blot檢測(cè) Beclin-1、ATG5、LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)Fig.8 Western blot detection of Beclin-1， ATG5， LC3Ⅱand p62 protein expressions

2.10 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬泡形成 透射電鏡結(jié)果顯示，control組和mimic NC組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體，內(nèi)含降解成分；而miR-30a組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，幾乎未見(jiàn)自噬體或自噬泡（圖9）。

圖9 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬泡的形成（×10 000）Fig.9 Transmission electron microscope observation of formation of autophagic vesicles of cells in each group （×10 000）

3 討論

EC是我國(guó)高發(fā)腫瘤，由于遺傳、飲酒、環(huán)境等因素使其發(fā)病率逐年升高。目前對(duì)EC治療以放療、化療為主，但預(yù)后較差［10］。尋找有效治療EC及延長(zhǎng)患者生存期的方法已成為重要研究方向。研究表明，miRNA可調(diào)控癌細(xì)胞中某些特定基因表達(dá)，也可作為癌基因或抑癌基因直接參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此，miRNA被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)［11］。作為miRNA的家族成員，miR-30a可作用于多個(gè)靶基因，其機(jī)制為通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控靶基因表達(dá)。miR-30a在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和自噬等方面發(fā)揮重要作用。如LIU等［12］通過(guò)抑制miR-30a表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬，從而降低膽固醇、減輕心肌缺血/再灌注損傷。杜晨陽(yáng)等［13］發(fā)現(xiàn)，miR-30a-3p通過(guò)靶向作用Caspase1介導(dǎo)的凋亡抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。FAN等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-30a-3p通過(guò)靶向調(diào)控胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體促進(jìn)EC轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)放療敏感性。QI等［15］發(fā)現(xiàn)，下調(diào) miR-30a-3p/5p通過(guò)抑制Wnt通路抑制ESCC細(xì)胞增殖。本研究顯示，GEO數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)EC組織中miR-30a表達(dá)升高，且患者預(yù)后較差，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-30a-mimic后，Eca-109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲明顯增強(qiáng)，自噬活性明顯降低。說(shuō)明miR-30a在EC中發(fā)揮促癌作用，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致。

Beclin-1基因（也稱BECN1基因），位于染色體17q21位置，是酵母ATG6的同系物，最早被鑒定為能夠調(diào)控自噬發(fā)生的蛋白，可誘導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡，具有抑癌功能，介導(dǎo)癌細(xì)胞自噬性死亡［16-18］。ATG5位于染色體6q21位置，自噬體膜形成早期需要類泛素蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)，ATG5與ATG12形成復(fù)合物，定位于自噬體膜表面，促進(jìn)自噬體膜伸展擴(kuò)張，誘導(dǎo)自噬體形成，ATG5去除后便能抑制自噬［19］。目前Beclin-1、ATG5在EC細(xì)胞增殖和自噬中的研究較少，如舒向芳等［20］發(fā)現(xiàn)，EC發(fā)生發(fā)展中，Beclin-1作為抑癌基因激活細(xì)胞自噬，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度消耗死亡。YANG等［21］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LINC00337會(huì)上調(diào)TPX2表達(dá)，從而增強(qiáng)ESCC細(xì)胞自噬和對(duì)順鉑的化學(xué)敏感性。鐘皓［22］證實(shí)順鉑通過(guò)誘導(dǎo)EC細(xì)胞EC109中ATG5表達(dá)，激活細(xì)胞自噬。本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-30a對(duì)Beclin-1、ATG5具有靶向調(diào)控作用，觀察到Human Protein Atlas和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中EC組織Beclin-1、ATG5表達(dá)減少，分析Beclin-1、ATG5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Beclin-1、ATG5表達(dá)越低，TNM分期越晚，腫瘤分化程度越低、浸潤(rùn)程度越高、淋巴結(jié)越易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞自噬是一種生物體內(nèi)高度保守的代謝途徑，是區(qū)別于壞死、凋亡的另一種細(xì)胞死亡形式，與腫瘤生成、發(fā)展相關(guān)［23］。自噬作為細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和生存至關(guān)重要［24］。LC3是自噬體膜蛋白，參與自噬形成各階段，可作為檢測(cè)自噬活動(dòng)的標(biāo)志物，發(fā)生自噬后，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3 Ⅱ，從而啟動(dòng)自噬［25］。p62作為自噬受體被運(yùn)送至自噬體內(nèi)降解，自噬發(fā)生時(shí)，p62蛋白水平下降，自噬抑制后p62蛋白則開始積累［26］。ZHANG等［27］發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的Beclin-1過(guò)表達(dá)能夠抑制EC細(xì)胞Eca109增殖，通過(guò)降低p62蛋白水平升高LC3 Ⅱ蛋白水平誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞自噬。LEE等［28］發(fā)現(xiàn)熊果酸通過(guò)降低ESCC細(xì)胞p62水平，提高LC3 Ⅱ水平抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。CAI等［29］發(fā)現(xiàn)氯喹通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 Ⅱ和p62蛋白表達(dá)發(fā)揮對(duì)EC109細(xì)胞的抗癌作用。本研究中，與mimic NC組相比，miR-30a組LC3 Ⅱ表達(dá)明顯降低，p62表達(dá)明顯升高，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)自噬泡形成，自噬活性下降。提示EC發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后可能與自噬活性降低有關(guān)。

綜上，本研究探討miR-30a靶向調(diào)控Beclin-1、ATG5在EC中的表達(dá)及臨床意義，證實(shí)Beclin-1、ATG5在EC中呈低表達(dá)且發(fā)揮抑癌作用，且與EC患者不良預(yù)后相關(guān)。Beclin-1、ATG5可能通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性從而發(fā)揮抑癌基因作用，為闡明miRNA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬在EC發(fā)生發(fā)展中的影響提供依據(jù)，為自噬相關(guān)基因作為EC新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。