張敬毅 蒲 兵 劉秀平 周肖龍 （淄博市第一醫(yī)院，淄博 255200）

越來(lái)越多的研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lnc-RNA）可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制miRNAs的表達(dá)水平，并且lncRNA/miRNAs軸可以通過(guò)各種經(jīng)典的信號(hào)通路或相關(guān)蛋白促進(jìn)肺癌的腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥性［1］。lncRNAs在肺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中對(duì)多靶點(diǎn)和多途徑的調(diào)節(jié)失調(diào)導(dǎo)致化療耐藥的發(fā)生［2］。LINC00617在乳腺癌樣本中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)激活Sox2的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，敲低LINC00617可抑制癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移［3］。本研究通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-218與LINC00617存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-218被報(bào)道在肺癌組織中低表達(dá)，miR-218過(guò)表達(dá)減弱了肺癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲、集落形成和腫瘤球體形成，并抑制了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)［4］。但 LINC00617 在肺癌中表達(dá)、作用及其與miR-218在肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞中的關(guān)系目前還尚未可知。主要研究LINC00617和miR-218對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞A549-Gem增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的影響，以期為肺癌的吉西他濱耐藥性研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自ATCC；引物、si-LINC00617和陰性對(duì)照 si-NC、miR-NC、miR-218 mimics（miR-218）均購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；鹽酸吉西他濱、胰蛋白酶、RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和A549-Gem耐藥細(xì)胞系的建立將A549細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃下含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)文獻(xiàn)［5］采用逐步增加培養(yǎng)基中吉西他濱濃度，間歇誘導(dǎo)的方式使A549細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。首先，將A549細(xì)胞培養(yǎng)在含10 nmol//L 吉西他濱的RPMI1640培養(yǎng)基中，24 h后換脫藥的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，待細(xì)胞恢復(fù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)再用較高濃度吉西他濱培養(yǎng)液篩選誘導(dǎo)，重復(fù)上述過(guò)程，連續(xù)培養(yǎng)40周，直至A549細(xì)胞可穩(wěn)定生長(zhǎng)于含終濃度1 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液中，獲得肺癌吉西他濱耐藥A549-Gem細(xì)胞。

1.2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 將吉西他濱處理或/和轉(zhuǎn)染后的A549、A549-Gem細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔150 μl細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后在培養(yǎng)液中加入終濃度為2、4、6、8 μmol/L的吉西他濱（約50 μl），以不加藥物只加培養(yǎng)液作為對(duì)照，培養(yǎng)72 h，每孔加入 20 μl CCK8溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A）值，波長(zhǎng)為450 nm。存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。并根據(jù)存活率計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)LINC00617和miR-218的表達(dá) 用Trizol試劑提取A549和A549-Gem細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒用于制備cDNA，取cDNA和RT-PCR試劑盒檢測(cè)LINC00617和miR-218的含量。引物如下：miR-218正向引物：5'-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3'，反向引物：5'-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3'；LINC00617正向引物：5'-ATTGGGAGGGGACTTAATGG-3'，反向引物：5'-GTGTTACGGAGCCAGGAGC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，反向引物 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。運(yùn)用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-Gem細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，細(xì)胞融合一層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將si-NC、si-LINC00617、miR-NC、miR-218、si-LINC00617+miR-NC、si-LINC00617+miR-218等各組載體或片段轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-LINC00617組、miR-NC組、miR-218組、si-LINC00617+miR-NC組、si-LINC00617+miR-218組。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，采用1.2.3方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549-Gem細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，洗滌并稀釋，以1×103個(gè)/孔接種入6孔板，加入6 μmol/L吉西他濱及10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，固定細(xì)胞并進(jìn)行結(jié)晶紫染色，拍照并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后的各組A549-Gem細(xì)胞，用含6 μmol/L吉西他濱無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，洗滌并稀釋為1×106個(gè)/ml，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取轉(zhuǎn)染后的各組A549-Gem細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（Ki67 1∶1 000、Caspase3抗體 1∶1 000和 GAPDH 抗體 1∶4 000），置于 4 ℃過(guò)夜孵育。PBST緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，顯影，拍照。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.4方法，在A549-Gem細(xì)胞中，將miR-218或miR-NC分別與構(gòu)建的LINC00617野生型（WT）和突變型（MUT）報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，在Promega雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中檢測(cè)上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示，在SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行整理分析，數(shù)據(jù)中兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析，組間多重比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌A549細(xì)胞和吉西他濱耐藥細(xì)胞A549-Gem對(duì)吉西他濱耐藥性的檢測(cè) 采用2、4、6、8 μmol/L的吉西他濱分別處理肺癌細(xì)胞A549和肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞A549-Gem，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著吉西他濱濃度的增加，A549細(xì)胞存活率逐漸降低，但A549-Gem的存活率無(wú)顯著改變，最高濃度8 μmol/L吉西他濱時(shí) A549-Gem的存活率（97.01±7.26）%顯著高于A549（43.21±5.35）%，見(jiàn)圖1。說(shuō)明A549-Gem細(xì)胞對(duì)吉西他濱具有顯著的耐藥性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)A549作用明顯，對(duì)A549-Gem生存無(wú)影響且作用效果較為明顯的濃度6 μmol/L。

圖1 A549和A549-Gem細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥性檢測(cè)Fig.1 Drug resistance of A549 and A549-Gem cells to gemcitabine

2.2 LINC00617在A549和A549-Gem細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)A549和A549-Gem細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00617 在A549-Gem中含量（3.19±0.14）顯著高于A549細(xì)胞（1.00±0.08）（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 LINC00617在肺癌A549和吉西他濱耐藥細(xì)胞A549-Gem中的表達(dá)Fig.2 Expression of LINC00617 in lung cancer A549 and gemcitabine resistant A549-Gem cells

2.3 抑制LINC00617對(duì)A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-LINC00617組A549-Gem細(xì)胞中LINC00617含量降低，細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。說(shuō)明抑制LINC00617聯(lián)合6 μmol/L吉西他濱處理可抑制A549-Gem細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)吉西他濱對(duì)細(xì)胞的抑制。

圖3 抑制LINC00617對(duì)A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Effects of inhibition of LINC00617 on proliferation and apoptosis of A549-Gem cells

2.4 LINC00617 靶 向 miR-218 TargetScan 對(duì)LINC00617靶向miR-218的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。miR-218組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC00617的螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性（0.20±0.02）是miR-NC組螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性（0.99±0.08）的0.20倍（P＜0.05），而miR-218組突變型MUT-LINC00617的熒光素酶相對(duì)活性（0.95±0.08）與miR-NC組（0.97±0.08）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑制LINC00617可上調(diào)miR-218含量（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 LINC00617的序列中含有與miR-218互補(bǔ)的核苷酸序列和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Fig.4 Sequence of LINC00617 contains nucleotide sequences complementary to miR-218 and dual-luciferase reporter assay system

2.5 miR-218對(duì)A549-Gem增殖、凋亡的影響 結(jié)果表明，與miR-NC組相比，miR-218組A549-Gem細(xì)胞中miR-218含量升高，A549-Gem細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)均降低，凋亡率升高，增殖蛋白Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-218聯(lián)合6 μmol/L吉西他濱可抑制A549-Gem細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)吉西他濱對(duì)細(xì)胞的抑制。

圖5 miR-218對(duì)A549-Gem增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-218 on proliferation and apoptosis of A549-Gem

2.6 miR-218可以增強(qiáng)抑制LINC00617對(duì)A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-LINC00617+miRNC組相比，si-LINC00617+miR-218組A549-Gem細(xì)胞中miR-218含量增高，細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)均降低，細(xì)胞凋亡率升高，Ki67含量降低，凋亡蛋白Caspase3含量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-218增強(qiáng)了抑制LINC00617對(duì)A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的作用。

圖6 miR-218可以增強(qiáng)抑制LINC00617對(duì)A549-Gem增殖、凋亡的影響Fig.6 miR-218 can enhanced and effect of LINC00617 inhibition on proliferation and apoptosis of A549-Gem

3 討論

肺癌確診時(shí)多為晚期，后期的臨床耐藥性是晚期肺癌患者治療的最大障礙，因此，提高肺癌細(xì)胞的化療敏感性具有重要意義［6］。lncRNA在耐藥和藥物敏感的肺癌細(xì)胞中出現(xiàn)差異表達(dá)，可能因?yàn)檎{(diào)控失調(diào)導(dǎo)致耐藥的發(fā)生［7］。

最近研究報(bào)道，LINC00617可能參與調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）的不對(duì)稱分裂，并促進(jìn)自我更新、耐藥性和EMT，從而影響不同癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［8］。LINC00617在乳腺癌樣本中表達(dá)上調(diào)，其可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲，誘導(dǎo)EMT并伴隨著干細(xì)胞特性的產(chǎn)生［3］。LINC00617在治療性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌（therapeutic neuroendocrine prostate cancer，tNEPC）中表達(dá)上調(diào)，與NEPC的發(fā)展有關(guān)，可能是NEPC的臨床生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［9］。但其在肺癌中的表達(dá)情況和作用尚不清楚。本研究通過(guò)建立肺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549-Gem，檢測(cè)不同濃度（2、4、6、8 μmol/L）的吉西他濱下肺癌A549和A549-Gem細(xì)胞的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吉西他濱對(duì)A549-Gem的抑制率顯著低于A549細(xì)胞，且LINC00617在A549-Gem細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，與上述結(jié)論類似，在A549-Gem細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-LINC00617聯(lián)合6 μmol/L吉西他濱處理可降低A549-Gem細(xì)胞的存活率和克隆形成數(shù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase3含量，下調(diào)增殖蛋白Ki67含量，說(shuō)明抑制LINC00617可降低A549-Gem細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性，其可能是肺癌潛在的化療增敏靶點(diǎn)［3，9］。

本研究通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-218與LINC00617存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-218在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，在宮頸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可靶向不同的基因抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲、凋亡和 EMT［10-13］。miR-218多態(tài)性可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌伊立替康化療反應(yīng)的標(biāo)志物［14］。miR-218在肺癌組織中表達(dá)水平較癌旁組織明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-218過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移、侵襲及EMT過(guò)程［15］。miR-218在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與卡鉑的耐藥及Mcl-1、Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控有關(guān)［16］。上述研究均表明miR-218與腫瘤進(jìn)展及耐藥性有關(guān)。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LINC00617靶向負(fù)調(diào)控miR-218的表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-218聯(lián)合吉西他濱可抑制A549-Gem細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-218可增強(qiáng)抑制LINC00617對(duì)A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性的作用，間接驗(yàn)證了在肺癌中兩者之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了與肺癌A549細(xì)胞相比，在肺癌DTX耐藥細(xì)胞A549-Gem中，LINC00617表達(dá)上調(diào)，LINC00617靶向miR-218調(diào)控A549-Gem細(xì)胞增殖、凋亡和吉西他濱耐藥性。LINC00617可能是肺癌吉西他濱化療增敏靶點(diǎn)。