黃建青 陳 陽 丘水林 童 艷 涂 梅 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，龍巖 364000）

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其患病率逐年攀升，嚴重影響患者的生命健康及生活質(zhì)量；近年來中醫(yī)藥治療糖尿病腎病具有一定優(yōu)勢，不良反應(yīng)較?。?-3］。仙茅苷是中藥仙茅的有效成分，可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激降低脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［4］。仙茅苷預(yù)處理可顯著改善細胞活力，降低心肌細胞凋亡［5］。仙茅苷可緩解海馬神經(jīng)元損傷，抑制海馬神經(jīng)元凋亡［6］。腎小管上皮細胞炎癥損傷與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)。研究報道缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中miR-1247-3p表達下調(diào)，上調(diào)miR-1247-3p可減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷［7］。miR-1247-3p能抑制氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的腦神經(jīng)細胞凋亡［8］。說明miR-1247-3p具有減輕細胞損傷作用。本研究旨在探究仙茅苷對高糖致腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響及機制是否與miR-1247-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞（腎小管上皮細胞）購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；D-葡萄糖購自艾美捷科技有限公司；仙茅苷購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（貨號：E-ELH0102c、E-EL-H0109c）；凋亡檢測試劑盒（貨號：QN1317）、RIPA蛋白裂解液（貨號：HR0259）購自北京百奧萊博科技有限公司；Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9抗體購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司（貨號：ABP0020、ABP50010）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：D350A）、熒光定量試劑盒（貨號：RR420A）購自大連寶生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668019）購自美國Invitrogen公司；anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p購自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)腎小管上皮細胞HK-2，用含5.5、25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細胞，分別作為正常對照組（Con）和高糖組（HG）；以0.5、5、50 μmol/L仙茅苷和25 mmol/L葡萄糖分別處理HK-2細胞，作為HG+仙茅苷低、中、高劑量實驗組；將miR-NC、miR-1247-3p分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞后用25 mmol/L葡萄糖處理，為HG+miR-NC組、HG+miR-1247-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞，再加25 mmol/L葡萄糖和50 μmol/L仙茅苷，設(shè)為HG+仙茅苷+anti-miR-NC組、HG+仙茅苷+anti-miR-1247-3p組。轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染前1 d培養(yǎng)細胞，使其轉(zhuǎn)染密度為90%左右，采用50 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1.0 μg質(zhì)粒；50 μl DMEM培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000試劑；5 min內(nèi)同稀釋的質(zhì)?；旌?；室溫靜置20 min；將復(fù)合物添加至含細胞的培養(yǎng)板中孵育6 h，然后加入藥物處理。

1.2.2 ELISA檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細胞培養(yǎng)48 h后的上清液，按照試劑盒說明操作，采用酶標儀測定OD450nm值，繪制標準曲線，根據(jù)樣品OD值計算相應(yīng)濃度。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h，PBS清洗細胞，加入300 μl結(jié)合緩沖液，Annexin V-FITC和PI避光孵育10 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后加入Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9抗體，4 ℃孵育過夜，然后加入二抗孵育2 h，曝光顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-1247-3p表達水平 提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，根據(jù)試劑盒說明進行PCR反應(yīng)，相對表達量采用 2-ΔΔCt法計算。miR-1247-3p 正向引物：5'-CCCCGGGAACGTCGAGACTGGAGC-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組獨立樣本比較方差齊行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響 與Con組相比，HG組腎小管上皮細胞中IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+仙茅苷低、中、高劑量組腎小管上皮細胞中IL-6、TNF-α水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05，表1）。

表1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.1 Effect of curculigoside on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9，pg/ml）

表1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.1 Effect of curculigoside on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9，pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P IL-6 42.12±3.69 133.14±11.191）92.49±7.952）74.22±6.992）3）56.48±4.972）3）4）204.139 0.000 TNF-α 16.13±1.45 85.82±6.971）66.68±4.152）45.22±4.392）3）28.25±2.152）3）4）391.162 0.000

2.2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響 與Con組相比，HG組HK-2細胞的凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；不同濃度仙茅苷處理后，細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達水平較HG組逐漸降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of curculigoside on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose （±s，n=9）

表2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of curculigoside on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05；compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P Apoptosis rate （%）7.13±0.69 33.33±3.011）24.34±2.022）16.99±1.052）3）10.23±0.842）3）4）331.080 0.000 Cleavedcaspase3 protein 0.27±0.02 0.84±0.061）0.67±0.052）0.51±0.042）3）0.36±0.032）3）4）265.750 0.000 Cleavedcaspase9 protein 0.19±0.02 0.64±0.051）0.49±0.042）0.37±0.032）3）0.25±0.022）3）4）256.966 0.000

圖1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

2.3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞miR-1247-3p表達的影響 與Con組相比，HG組HK-2細胞中miR-1247-3p表達水平降低（P＜0.05）；與HG組相比，仙茅苷低、中、高劑量組HK-2細胞中miR-1247-3p表達水平逐漸升高，呈劑量依賴性（P＜0.05，表3）。

表3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞miR-1247-3p表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of curculigoside on expression of miR-1247-3p in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9)

表3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞miR-1247-3p表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of curculigoside on expression of miR-1247-3p in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9)

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05；compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P miR-1247-3p 1.00±0.00 0.31±0.031）0.52±0.042）0.66±0.052）3）0.82±0.062）3）4）370.570 0.000

2.4 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-1247-3p組miR-1247-3p表達水平升高，IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05，表4）。

表4 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1247-3p overexpression on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表4 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1247-3p overexpression on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-1247-3p t P miR-1247-3p 1.00±0.00 3.09±0.261）24.115 0.000 IL-6/（pg·ml-1）135.04±11.79 64.17±5.571）16.305 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）86.59±6.65 36.69±3.241）20.237 0.000

2.5 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-1247-3p組腎小管上皮細胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達水平降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表5 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-1247-3p t P Apoptosis rate（%）33.97±3.12 13.86±1.151）18.143 0.000 Cleavedcaspase3 protein 0.86±0.05 0.45±0.041）19.209 0.000 Cleavedcaspase9 protein 0.67±0.05 0.32±0.041）16.398 0.000

圖2 miR-1247-3p過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

2.6 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥損傷的作用 與HG+仙茅苷+anti-miR-NC 組相比，HG+仙茅苷（50 μmol/L）+anti-miR-1247-3p組miR-1247-3p表達水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，細胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達水平升高（P＜0.05，圖3、表6、表7）。

表6 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞miR-1247-3p表達和炎癥因子的作用（±s，n=9）Tab.6 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on miR-1247-3p expression and inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表6 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞miR-1247-3p表達和炎癥因子的作用（±s，n=9）Tab.6 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on miR-1247-3p expression and inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+curculigoside+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+curculigoside+anti-miR-NC HG+curculigoside+anti-miR-1247-3p t P miR-1247-3p 1.00±0.00 0.42±0.041）43.500 0.000 IL-6/（pg·ml-1）54.75±4.92 108.73±10.031）14.496 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）26.91±3.09 73.71±5.741）21.537 0.000

表7 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表7 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+curculigoside+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+curculigoside+anti-miR-NC HG+curculigoside+10.03±0.93 Apoptosis rate（%）anti-miR-1247-3p t P 25.23±2.181）19.240 0.000 0.35±0.03 0.75±0.051）20.580 0.000 0.24±0.02 0.55±0.041）20.795 0.000 Cleavedcaspase3 protein Cleavedcaspase9 protein

圖3 下調(diào)miR-1247-3p表達和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用Fig.3 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎病發(fā)病機制復(fù)雜，慢性炎癥反應(yīng)、腎小管上皮細胞凋亡、腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化等均與其相關(guān)，腎小管上皮細胞損傷可促進多種炎癥因子分泌，導(dǎo)致間質(zhì)炎癥［9-11］。因此，抑制腎小管上皮細胞炎癥損傷是防治糖尿病腎病的重要途徑。研究表明中藥具有抑制腎小管上皮細胞損傷及炎癥作用［12-13］。研究報道仙茅苷預(yù)處理可減少過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，保護心肌細胞免受氧化損傷［14］。仙茅苷可激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)從而減輕腦組織損傷，保護腦組織的結(jié)構(gòu)和功能［15］。本研究采用不同濃度仙茅苷處理高糖作用的HK-2細胞，結(jié)果顯示，隨著仙茅苷濃度增加，高糖損傷的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平逐漸降低，細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達水平逐漸降低，顯示出明顯的量效關(guān)系，提示仙茅苷能夠減輕高糖損傷腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)。

miRNA參與調(diào)控細胞損傷過程。研究報道m(xù)iR-1247-3p與機體炎癥反應(yīng)直接相關(guān)［16］。miR-1247-3p可參與調(diào)控肺泡上皮細胞損傷過程［17］。而miR-1247-3p對損傷的腎小管上皮細胞影響作用尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示：高糖誘導(dǎo)損傷HK-2細胞中miR-1247-3p表達水平降低，miR-1247-3p過表達后，IL-6、TNF-α水平降低，HK-2細胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達水平降低；表明miR-1247-3p過表達可抑制高糖作用的腎小管上皮細胞凋亡及炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)仙茅苷能增加miR-1247-3p表達水平，且通過antimiR-1247-3p驗證了下調(diào)miR-1247-3p表達可逆轉(zhuǎn)仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥損傷。提示仙茅苷可能通過上調(diào)miR-1247-3p表達，從而減少高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)與細胞凋亡。