牛學(xué)剛 劉朝旭 劉一帆 （聊城市中醫(yī)醫(yī)院骨創(chuàng)傷科，聊城 252000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化、骨結(jié)構(gòu)改變、滑膜炎癥和疼痛為特征的常見退行性關(guān)節(jié)?。?］。非甾體抗炎藥是目前OA治療的常用手段，能夠有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，晚期OA患者治療則采用常規(guī)關(guān)節(jié)置換手術(shù)，但均有一定局限性［2］。

miRNAs已成為骨骼病理生理學(xué)中有前途的治療靶點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)OA進(jìn)展［3-5］。最新研究顯示，miR-376-3p在OA軟骨組織中異常低表達(dá)，高水平的miR-376b-3p能夠減輕OA細(xì)胞炎癥損傷，發(fā)揮保護(hù)作用［6］。另外，人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）可分泌攜帶 miRNAs的外泌體（exosome，exo），對(duì)OA起保護(hù)作用［7］。MYC是作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖，包括靶基因轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，MYC能夠激活MAPK通路進(jìn)而促進(jìn)OA進(jìn)展［8］。本研究以miR-376b-3p為切入點(diǎn)探索exo源性miR-376b-3p調(diào)控MYC參與OA進(jìn)程的具體機(jī)制，為OA治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HC-A細(xì)胞購于美國典型菌株保藏中心；LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司；載體及PCR引物購于南京金斯瑞生物科技有限公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司；ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；相關(guān)抗體均為英國Abcam公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染序列由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購于上海翊圣；Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit、SYBR Premix Ex Taq 購于美國Thermo Fisher；GW 4869外泌體抑制劑購于翌圣生物。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫的GEO數(shù)據(jù)庫獲取miRNAs差異表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集GSE79258，包括2個(gè)腰椎間盤突出（lumbar disc herniation，LDH）患者關(guān)節(jié)軟骨樣本和2個(gè)OA患者關(guān)節(jié)軟骨樣本miRNA測(cè)序信息。Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）和 Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查詢miR-376b-3p下游靶基因，在線工具Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖。借助KOBAS在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行KEGG功能富集分析，DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）查詢OA疾病風(fēng)險(xiǎn)基因（C0409959）。String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）分析蛋白互作關(guān)系。

1.2.2 組織樣本采集 人滑膜樣本取自2019年12月至2020年12月于聊城市中醫(yī)醫(yī)院進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的59例OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨，術(shù)中無菌提取和分離患者滑膜組織，男性23例，女性36例，平均年齡（62.15±3.12）歲。選取同期在聊城市中醫(yī)醫(yī)院因外部創(chuàng)傷行膝關(guān)節(jié)截肢手術(shù)的15例患者作為對(duì)照組（Non-OA）。Non-OA組患者過往無膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷及手術(shù)史，臨床資料完整且未合并器質(zhì)性疾病或自身免疫病。OA組患者根據(jù)Kellgren和Lawrence分級(jí)系統(tǒng)（Kellgrenand Lawrence grading，KLG）分為Early OA組（KLG＜2，n=16）、Middle OA組（KLG=2，n=29）和Late OA組（KLG＞2，n=14）。OA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)推薦的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床病歷資料完整；③未患有其他反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾?。虎芙谖词褂眠^糖皮質(zhì)激素或甾體類抗炎藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過膝關(guān)節(jié)相關(guān)手術(shù)；②合并有器質(zhì)性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病及其他可能影響本研究結(jié)果的疾病患者。本研究方案經(jīng)聊城市中醫(yī)醫(yī)院院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者及家屬知情同意。

1.2.3 SMSCs分離與鑒定 OA滑膜標(biāo)本用PBS沖洗，剪為1 mm3組織碎塊，加入約10倍體積的Ⅱ型膠原酶消化3 h，過100目篩，1 500 r/min離心5 min，含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基重懸后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后傳代。取第五代細(xì)胞，采用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，含3%BSA的PBS孵育30 min，添加APC熒光Anti-CD34抗體、PE熒光Anti-CD44抗體、APC熒光Anti-CD73抗體及FITC熒光Anti-CD45抗體，流式細(xì)胞儀對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行表型分析。CD34、CD45低表達(dá)，CD44和CD73高表達(dá)提示SMSCs分離成功。

1.2.4 SMSCs源性exo分離與鑒定 取細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入0.2 ml分離純化溶液充分混勻，4 ℃孵育過夜，離心，去除殘余溶液，沉淀即為exo。透射電鏡觀察exo形態(tài)并拍照，Western blot檢測(cè)exo標(biāo)志蛋白表達(dá)。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 HC-A細(xì)胞復(fù)蘇后采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，補(bǔ)充10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞達(dá)到80%融合后0.25%胰蛋白酶消化傳代，將第三代細(xì)胞分別用10 ng/ml IL-1β培養(yǎng)0 h、3 h、6 h、12 h，建立OA體外細(xì)胞模型。

1.2.6 轉(zhuǎn)染與分組 將inhibitor-NC、miR-376b-3p inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長期SMSCs，按1.2.4分離exo，將pc-DNA3.1、pc-MYC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長期HC-A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。收集不同轉(zhuǎn)染組SMSCs-Exo與不同組轉(zhuǎn)染H-CA細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，配制GW6849工作液至1.43 mmol/L，加入細(xì)胞培養(yǎng)基處理30 min。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá) TRIzol法提取總RNA，Nanodrop紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度、純度，采用Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)試劑盒為SYBR Premix Ex Taq，以cDNA為模板，以特異性引物為正向引物進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)。miR-376b-3p以U6為內(nèi)參，MYC以GAPDH為內(nèi)參。Real-Time PCR 儀進(jìn)行相應(yīng)PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞離心，沉淀中加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液冰上振蕩裂解30 min，轉(zhuǎn)移上清，按BCA試劑盒說明對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量分析。取蛋白樣本10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST溶液阻斷，洗膜，加入稀釋的一抗GAPDH（1∶1 000）、CD9（1∶2 000）、CD63（1∶1 000）、Calnexin（1∶1 000） 4 ℃孵育，次日取出，室溫復(fù)蘇1 h，TBST沖洗10 min，添加過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（1∶1 000）孵育2 h，TBST沖洗，ECL化學(xué)發(fā)光液滴加至PVDF膜，自動(dòng)凝膠成像儀拍照，Image J量化分析目標(biāo)條帶蛋白表達(dá)強(qiáng)度，根據(jù)GADPH進(jìn)行歸一化處理。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向關(guān)系 根據(jù)在線生物預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的特異性結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增MYC 3'UTR片段，克隆至熒光素酶報(bào)告載體，即MYC-WT。再對(duì)原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，擴(kuò)增并克隆至載體，即MYC-MUT。將以上質(zhì)粒分別與mimic-NC、miR-376b-3p mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，按LipofectamineTM3000試劑盒說明進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h后按雙熒光素酶基因報(bào)告試劑盒說明檢測(cè)，以海腎熒光素酶為對(duì)照熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行歸一化。

1.2.10 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 共培養(yǎng)后將細(xì)胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h，檢測(cè)490 nm處吸光度。各樣品檢測(cè)3次。

1.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組共培養(yǎng)的HC-A細(xì)胞接種至96孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%～80%融合時(shí)加入PBS緩沖液調(diào)整濃度，制成細(xì)胞懸液，加入 Annexin V-FITC/PI各 5 μl，混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀下檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡。

1.2.12 ELISA檢測(cè)免疫相關(guān)因子分泌水平 取細(xì)胞上清，常規(guī)梯度密度離心去除懸浮顆粒物，ELISA試劑盒檢測(cè)上清中TNF-α、IL-6水平，按試劑盒說明操作，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度（OD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布與方差齊性的計(jì)量資料采用±s表示，采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析結(jié)合Tukey's檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以n表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA組織與細(xì)胞系中miR-376b-3p表達(dá)下調(diào)篩選GSE79258數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-376b-3p在OA組織中表達(dá)顯著低于LDH組織（圖1A）。相對(duì)于Non-OA組，OA組織中miR-376b-3p表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖1B）。進(jìn)一步根據(jù)KLG分級(jí)檢測(cè)不同階段OA患者miR-376b-3p表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-376b-3p水平隨病程延長而下降（均P＜0.05，圖1C）。IL-1β處理后發(fā)現(xiàn)，與0 h相比，IL-1β處理的HC-A細(xì)胞miR-376b-3p表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào)（均P＜0.05，圖1D）。提示miR-376b-3p低表達(dá)可能與OA發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖1 OA組織與細(xì)胞系中miR-376b-3p表達(dá)下調(diào)Fig.1 miR-376b-3p expression was down-regulated in both OA tissue and cells

2.2 SMSCs源性exo中miR-376b-3p表達(dá)增加 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73和SMSCs標(biāo)志物CD44陽性表達(dá)率分別為98.59%、99.54%，而CD34和CD45陽性表達(dá)率僅為1.59%、0.38%，提示SMSCs分離成功。透射電鏡下可見exo具有雙層膜結(jié)構(gòu)的圓盤狀顆粒（圖2A）。Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，CD9與CD63在exo中高表達(dá)，而Calnexin在SMSCs-Exo組不表達(dá)（均P＜0.05，圖2B），SMSCs-Exo鑒定成功。將HC-A細(xì)胞與SMSCs-Exo共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，相對(duì)于HC-A組，HC-A+SMSCs-Exo組miR-376b-3p表達(dá)增加（均P＜0.05），加入exo抑制劑GW4869后miR-376b-3p表達(dá)被抑制（均P＜0.05，圖2C），提示SMSCs-Exo能夠攜帶miR-376b-3p進(jìn)入HC-A細(xì)胞。

圖2 SMSCs源性exo分離及miR-376b-3p表達(dá)Fig.2 Exo separated from SMSCs and expression of miR-376b-3p

2.3 SMSCs源性exo能抑制軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)其增殖 IL-1β可顯著抑制HC-A細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)可被SMSCs-Exo部分逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05，圖3A、B）。ELISA結(jié)果顯示，IL-1β可提高TNF-α、IL-6水平，這些變化可被SMSCs-Exo部分逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05，圖3C）。提示SMSCs-Exo可促進(jìn)HC-A細(xì)胞增殖，抑制其凋亡和炎癥反應(yīng)，改善OA軟骨細(xì)胞炎癥損傷。

圖3 SMSCs源性exo抑制軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)并促進(jìn)其增殖Fig.3 Apoptosis and inflammatory response of chondrocyte were inhibited and proliferation was promoted by SMSCs-derived exo

2.4 SMSCs通過調(diào)控miR-376b-3p減輕OA損傷qRT-PCR顯示，SMSCs-miR-inhibitor-Exo組miR-376b-3p表達(dá)較陰性轉(zhuǎn)染SMSCs-inhibitor-NC-Exo組顯著降低（均P＜0.05，圖4A）。與陰性對(duì)照組相比，與SMSCs-miR-inhibitor-Exo共培養(yǎng)的HC-A細(xì)胞miR-376b-3p表達(dá)顯著降低（均P＜0.05，圖4B）。SMSCs-miR-inhibitor-Exo組較SMSCs-inhibitor-NC-Exo組細(xì)胞增殖活力降低、凋亡率升高，炎癥因子TNF-α和IL-6水平上調(diào)（均P＜0.05，圖4C～E）。提示SMSCs-Exo通過分泌miR-376b-3p有效抑制OA進(jìn)展。

圖4 SMSCs通過調(diào)控miR-376b-3p抑制OA進(jìn)展Fig.4 SMSCs inhibits progression of OA by regulating miR-376b-3p

2.5 MYC是miR-376b-3p的下游靶點(diǎn) TargetScan和StarBase獲取miR-376b-3p的下游靶基因并取交集，結(jié)果顯示，共有528個(gè)交集基因（圖5A）；KEGG功能富集分析結(jié)果顯示，miR-376b-3p的靶基因顯著富集于干細(xì)胞多能性信號(hào)通路（圖5B）；將該通路的16個(gè)基因與DisGeNET獲取的OA疾病風(fēng)險(xiǎn)基因（C0409959：GDF5、SBNO1、LTBP1和WWP2）進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果顯示，MYC與OA風(fēng)險(xiǎn)基因及干細(xì)胞多能性通路相關(guān)基因具有較強(qiáng)的相關(guān)性（圖5C）。miR-376b-3p可直接靶向作用于MYC（均P＜0.05，圖5D、E）。OA組MYC表達(dá)較Non-OA組上調(diào)（均P＜0.05，圖5F），且與OA中miR-376b-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.287 2，P=0.027 4，圖5G），提示MYC可能作為miR-376b-3p的下游靶點(diǎn)在OA中損傷軟骨細(xì)胞。

圖5 MYC是miR-376b-3p的下游靶點(diǎn)Fig.5 MYC is downstream target of miR-376b-3p

2.6 MYC促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)并抑制其增殖，exo源性miR-376b-3p可部分逆轉(zhuǎn)該作用 qRTPCR結(jié)果顯示，MYC能穩(wěn)定高表達(dá)于轉(zhuǎn)染pc-MYC的細(xì)胞（P＜0.05，圖6A）。共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與pc-MYC組相比，pc-MYC+SMSCs-Exo組MYC表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，圖6B）。功能試驗(yàn)結(jié)果顯示，與pc-DNA3.1組相比，pc-MYC組細(xì)胞增殖活力降低、凋亡數(shù)增加、TNF-α及IL-6水平升高（均P＜0.05），而與pc-MYC組相比，pc-MYC+SMSCs-Exo組細(xì)胞增殖活力升高、凋亡率、TNF-α 及 IL-6水平降低（均P＜0.05，圖6C～E）。提示exo中高水平的miR-376b-3p通過負(fù)調(diào)控MYC表達(dá)抑制OA進(jìn)展。

圖6 SMSCs-Exo源性miR-376b-3p/MYC對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響Fig.6 Effects of SMSCs-Exo derived miR-376b-3p/MYC on proliferation，apoptosis and inflammatory response of chondrocytes

3 討論

研究顯示，exo是一類雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，直徑約100 nm，由不同類型活細(xì)胞分泌，與其源性細(xì)胞具有類似生物功能，但不產(chǎn)生明顯免疫原性或致瘤性等不良反應(yīng)，通過攜帶蛋白和遺傳物質(zhì)等作為載體將信息穩(wěn)定傳遞至受體細(xì)胞，與受體細(xì)胞融合并調(diào)控基因表達(dá)［9］。SMSCs源性exo在OA治療中的作用不可或缺，如SMSCs源性exo可顯著改善OA關(guān)節(jié)內(nèi)衰老細(xì)胞積累的微環(huán)境［10］。SMSCs源性exo能將miR-140-5p傳遞至軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖［11］。miR-31經(jīng)SMSCs源性exo包裝、攜帶，傳遞至軟骨細(xì)胞，通過調(diào)控KDM2A基因促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、遷移及軟骨形成，有效改善了OA導(dǎo)致的軟骨損傷和炎癥［12］。因此認(rèn)為SMSCs源性exo可有效治療并預(yù)防OA。

為尋找更有效的生物靶向分子，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-376b-3p在OA組織中表達(dá)下調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs對(duì)OA發(fā)揮抗凋亡和抗炎作用，其中包含miR-376b-3p［6］。本研究通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，miR-376b-3p在OA中異常低表達(dá)，且隨著OA病程延長表達(dá)逐漸下調(diào)。軟骨退化、軟骨細(xì)胞衰老是OA的主要特征，而IL-1β是一種促炎癥細(xì)胞因子，可導(dǎo)致軟骨組織及細(xì)胞損傷［13］。因此本研究在體外采用促炎因子IL-1β誘導(dǎo)并模擬OA損傷建立細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)miR-376b-3p水平呈時(shí)間依賴性下調(diào)。隨后從滑膜組織中分離SMSCs，并進(jìn)一步從SMSCs中分離exo，將exo與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，SMSCs源性exo可減輕IL-1β誘導(dǎo)的HC-A細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，提高細(xì)胞增殖活力。而抑制SMSCs源性exo中miR-376b-3p表達(dá)，該效果減弱，提示SMSCs源性exo抑制OA進(jìn)程的作用可能通過攜帶高水平miR-376b-3p實(shí)現(xiàn)。

為探索SMSCs源性exo攜帶的miR-376b-3p對(duì)OA的具體作用機(jī)制，本研究借助一系列在線生物預(yù)測(cè)網(wǎng)站，結(jié)合文獻(xiàn)篩選并確定miR-376b-3p的下游靶基因MYC。MYC被證明可影響破骨細(xì)胞分化，且與OA發(fā)病機(jī)制緊密相關(guān)［14］。在大鼠早期OA踝突軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)踝突軟骨細(xì)胞增殖、肥大和遷移［15］。本研究證明MYC具有促OA炎癥損傷作用，而該作用能被攜帶高水平miR-376b-3p的exo部分逆轉(zhuǎn)，表明SMSCs源性exo中miR-376b-3p可影響OA進(jìn)展，該作用可能通過調(diào)節(jié)MYC基因?qū)崿F(xiàn)。

綜上，SMSCs源性exo能夠攜帶miR-376b-3p通過調(diào)控MYC表達(dá)參與OA進(jìn)展，首次提出SMSCs源性exo中的miR-376b-3p可被用作OA的治療性生物標(biāo)志物，為OA治療策略研究提供了新的視角。本研究未針對(duì)性開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且樣本量有限，因此仍存在一定局限性。