范 瑾， 喬 昀， 程 斌

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 200021；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，上海 201266）

目前，臨床對由陰道毛滴蟲引起的滴蟲性陰道炎（trichomonal vaginitis，TV）已有有效的治療方法，但若治療不徹底，極易復發(fā)[1]，嚴重影響女性身心健康。TV與胎膜早破、不孕等不良圍產(chǎn)結局有關[2-3]，早期有效、徹底地進行治療有較大的臨床意義。本研究擬通過了解已婚育齡TV患者陰道內(nèi)微生物群組成特征，為TV的臨床診治和預防復發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年5月—2021年3月在上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院診治的TV患者54例（TV組）。TV診斷標準：陰道分泌物0.9% NaCl溶液懸滴液可見活滴蟲，伴或不伴相應外陰瘙癢、陰道分泌物增多且有異味、下腹痛等臨床癥狀[3]。納入標準：（1）＜45歲，平時月經(jīng)正常，未妊娠；（2）陰道無出血，3 d內(nèi)無性生活、陰道局部用藥或陰道操作者；（3）2周內(nèi)未使用抗菌藥物；（4）自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標準：（1）患自身免疫性疾病等系統(tǒng)性疾?。唬?）3個月內(nèi)口服避孕藥等性激素；（3）臨床資料不全。54例患者中，卵泡期42例、黃體期12例；陰道分泌物清潔度Ⅲ度39例、Ⅳ度15例。另選取同期體檢健康女性64例（健康對照組），年齡27～44歲，平素月經(jīng)正常，無陰道炎癥表現(xiàn)；其中卵泡期48例、黃體期16例；陰道分泌物清潔度Ⅰ度56例、Ⅱ度8例；排除外陰陰道滴蟲、念珠菌病患者。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 婦科常規(guī)檢查 對所有研究對象進行婦科常規(guī)檢查，用無菌棉簽采集其陰道上1/3處分泌物，稀釋后勻涂抹于潔凈的載玻片上，制成陰道分泌物濕片和懸滴片，鏡下觀察是否存在滴蟲、陰道加德納菌、霉菌、念珠菌，并觀察細胞形態(tài)、線索細胞情況，觀察病原菌形態(tài)和活動情況，評估白帶清潔度。陰道分泌物（白帶）清潔度評估標準：微生物以陰道桿菌為主，鏡下可見大量上皮細胞，判定為Ⅰ度；鏡下出現(xiàn)部分陰道桿菌和上皮細胞，判定為Ⅱ度；鏡下膿細胞和雜菌數(shù)量多，陰道桿菌和上皮細胞量稀少，判定為Ⅲ度；鏡下幾乎全為膿細胞和大量雜菌，無陰道桿菌，判定為Ⅳ度。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 收集所有研究對象陰道拭子，采用SYBER Green I Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量檢測試劑盒（貨號DRR081A，北京賽百盛公司）提取基因組DNA，-70 ℃冷凍保存。以細菌的保守通用區(qū)序列設計引物作為樣本的內(nèi)參[4]（由上海英俊生物公司合成），參照文獻[4]報道的21種陰道常見細菌的特異引物序列合成特異性引物，采用美國ABI公司7500 Fast儀進行RT-qPCR擴增，嚴格按說明書要求進行操作。

1.2.3 菌群密集度分級 菌群密集度主要通過細菌分布和排列情況直接判斷并分級[5]。將所有研究對象陰道分泌物樣本均勻涂片并革蘭染色，于100倍油鏡下觀察30個視野，每個視野細菌平均數(shù)為 1～9判定為1級，10～99判定為2級，≥100判定為3級，細菌密集成團等無法計算判定為4級。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Metastats 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Graph Prism 9.0軟件作圖。對所有陰道分泌物樣本中細菌的豐度進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TV組和健康對照組陰道分泌物革蘭染色結果

TV組陰道分泌物中的優(yōu)勢菌為革蘭陰性短桿菌，密集度為Ⅲ級；健康對照組陰道分泌物中的優(yōu)勢菌為革蘭陽性乳桿菌，密集度為Ⅱ級。見圖1。

圖1 TV組和健康對照組革蘭染色結果（×100）

2.2 TV組和健康對照組陰道分泌物微生物組成

21種常見微生物分析結果顯示，64名健康對照者陰道分泌物中的微生物主要為Lactobacillus iners、Lactobacillus crispatus、Gardnerella vaginalis，其中16名優(yōu)勢菌為Lactobacillus iners，24名優(yōu)勢菌為Lactobacillus iners和Lactobacillus crispatus，18名優(yōu)勢菌為Lactobacillus crispatus，以Gardnerella vaginalis厭氧性型為優(yōu)勢菌的6名（B2、B18）。除Gardnerella vaginalis外，B18還存在組成表現(xiàn)為多樣化的其他菌群，如Bacterial Vaginosis-Associated Bacteria（BVABla、BVAB2a、BVAB3a）；見圖2。54例TV患者陰道分泌物微生物主要為Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii、Sneathia sanguinegens，其中以Lactobacillus iners為優(yōu)勢菌的有4例（A13、A14），以Prevotella為優(yōu)勢菌的有25例，以Leptotrichia amnionii為優(yōu)勢菌的有17例，以Sneathia sanguinegens為優(yōu)勢菌的有8例；見圖2。Metastats比較結果顯示，2個組陰道分泌物21種常見微生物組成差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PCA結果顯示，2個組21種細菌的豐度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 2個組陰道分泌物微生物組成情況

3 討論

TV是全球范圍內(nèi)最普遍的寄生蟲所致婦科炎癥性疾病，有研究結果顯示，女性孕期發(fā)生TV會明顯增加早產(chǎn)、胎膜早破、分娩低體質(zhì)量兒、新生兒智力殘疾等不良妊娠結局的發(fā)生率，且滴蟲感染與宮頸癌也存在一定關聯(lián)[6]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增TV患者約1.7億例，其中北美地區(qū)人群感染率高達60%，為高發(fā)區(qū)，主要通過性傳播感染；因不能較好地認知后遺癥和經(jīng)濟條件限制，TV易被患者忽視，通常發(fā)展中國家貧困地區(qū)婦女發(fā)病率高，發(fā)達國家發(fā)病率低；毛滴蟲感染與患者性別、年齡、種族息息相關，以女性為主，同時有多個性伴侶、吸毒、淋球菌感染等也是TV的危險因素[7-8]。育齡期女性體內(nèi)激素水平適宜滴蟲生存，且處于性活躍期，較易發(fā)生毛滴蟲感染。有研究發(fā)現(xiàn)，配偶感染是毛滴蟲感染最主要的感染因素，提示性生活的間接或直接接觸是已婚育齡女性不可忽視的感染途徑[10]。另外，發(fā)生TV的育齡期女性也易合并單純皰疹病毒、支原體、梅毒等其他性傳播疾病。因此，早診斷、早治療TV非常重要。

目前，臨床診斷毛滴蟲感染一般采用傳統(tǒng)的濕片法顯微鏡檢查，快捷、經(jīng)濟，檢測陰道分泌物標本特異性較高，但敏感性僅為60%～70%[3]；檢測男性樣本的敏感性更低。培養(yǎng)法作為診斷的金標準，耗時較長，一般需2～7 d才能出具報告，且培養(yǎng)法易受培養(yǎng)基、標本質(zhì)量、鏡檢者技術水平影響。RT-qPCR可以明顯提高TV診斷的敏感性、特異性[10-11]。TV患者陰道內(nèi)微生物種類繁多，相互共生與拮抗，若受到外界毛滴蟲入侵，內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，會有利于毛滴蟲進一步在宿主機體內(nèi)寄生和侵襲，導致陰道內(nèi)環(huán)境的糖原被陰道毛滴蟲大量分解吸收，引起陰道物質(zhì)組成部分缺失，菌群穩(wěn)態(tài)失衡[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，TV患者的陰道分泌物涂片中乳桿菌數(shù)量明顯減少，其他菌成為優(yōu)勢菌[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，健康女性陰道微生態(tài)主要由乳酸桿菌、棒狀桿菌、表皮葡萄球菌、陰道加德納菌等多種菌屬組成，其中乳酸桿菌所占比例最高；而部分陰道菌群失調(diào)者優(yōu)勢乳酸桿菌所占比例下降，陰道加德納菌和其他厭氧菌所占比例增加，最終引發(fā)細菌性陰道病，并誘發(fā)各類臨床癥狀[15]。本研究結果顯示，TV患者陰道分泌物主要是革蘭陰性短桿菌，密集度為Ⅲ級，而健康對照者陰道分泌物主要以革蘭陽性乳桿菌為優(yōu)勢菌，密集度為Ⅱ級，與相關研究結果[16]一致。本研究中，64名健康對照者陰道分泌物微生物組成主要為Lactobacillus iners、Actobacillus crispatus和Gardnerella vaginalis，而54例TV患者陰道分泌物微生物組成主要為Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii和Sneathia sanguinegens。Metastats比較結果顯示，2個組陰道分泌物21種常見微生物組成差異和豐度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示TV患者的陰道分泌物微生物組成與健康對照者存在明顯差異，TV患者陰道中厭氧性Prevotella和Leptotrichia amnionii菌群與健康對照者檢出率有明顯差異，與相關研究結果[17]一致。

綜上所述，分析育齡期TV患者的陰道微生物群組成和感染狀況，可為臨床TV對癥治療提供參考，有利于改善TV患者陰道內(nèi)環(huán)境。