王 芳， 鄧燕燕， 林見敏， 王金金， 龔 倩， 黃聲雷

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院檢驗科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

碳青霉烯類藥物因其良好的細(xì)胞通透性和高度的酶穩(wěn)定性，一度被認(rèn)為是抗多重耐藥腸桿菌目細(xì)菌的最后“一道防線”[1]。但是隨著該類抗菌藥物在臨床的過度使用，碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE）在全球范圍內(nèi)廣泛流行。全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)歷年監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2014—2019年，我國臨床分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從4.8%上升至10.5%，對美羅培南的耐藥率從4.5%上升至10.9%；上海市碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的臨床分離率從18.9%快速攀升至28.7%[2]。腸桿菌目細(xì)菌對碳青霉烯類藥物最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶。按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為絲氨酸酶（A類，以blaKPC為主）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（B類，以blaNDM為主）和絲氨酸碳青霉烯酶（D類，以blaOXA-48為主）三大類。不同類型碳青霉烯酶的分布具有地區(qū)、人群和細(xì)菌種類的差異性，我國臨床分離的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶分別以KPC和NDM型為主，少數(shù)菌株產(chǎn)OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[4]。《腸桿菌目細(xì)菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規(guī)范專家共識》[5]推薦改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）/乙二胺四乙酸碳青霉烯滅活試驗（ethylene diamine tetraacetic acidcarbapenem inactivation method，eCIM）和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗為臨床微生物實驗選擇性常規(guī)開展的檢測方法。本研究擬評估m(xù)CIM/eCIM和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗鑒定腸桿菌目細(xì)菌碳青霉烯酶型別的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年1月—2020年1月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院分離自住院患者臨床樣本的腸桿菌目細(xì)菌130株，其中CRE100株（肺炎克雷伯菌72株、大腸埃希菌18株、陰溝腸桿菌8株、黏質(zhì)沙雷菌2株）；碳青霉烯類敏感腸桿菌目細(xì)菌30株，包括肺炎克雷伯菌15株、大腸埃希菌12株、黏質(zhì)沙雷菌3株。

1.2 試劑和儀器

VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）。M-H瓊脂平板、哥倫比亞血平板（上海科瑪嘉公司），亞胺培南和美羅培南紙片（美國賽默飛世爾公司），黏菌素和替加環(huán)素微量肉湯稀釋板條（溫州康泰公司），乙二胺四乙酸二鈉和碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試劑（上海原科公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定和體外藥物敏感性試驗 采用VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏儀對臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會M100-S28文件[6]標(biāo)準(zhǔn)判讀藥物敏感性試驗結(jié)果，頭孢哌酮-舒巴坦參照頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)。黏菌素和替加環(huán)素的藥物敏感性結(jié)果依據(jù)文獻(xiàn)[7]的要求進(jìn)行判斷。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、（ATCC 35218）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。

1.3.2 mCIM/eCIM 按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會M100-S28文件[6]要求進(jìn)行mCIM/eCIM和結(jié)果判讀。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-1705）、（ATCC BAA-1706）和（ATCC BAA-2146）。

1.3.3 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗 將待測菌調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，均勻涂布于M-H瓊脂平板，分別將4張10 μg/片的亞胺培南紙片（分別標(biāo)記為A、B、C、D）貼于瓊脂上，紙片之間距離＞5 mm。B紙片上加初始濃度為0.1 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液10 μL，C紙片上加初始濃度為30 mg/L的3-氨基苯基硼酸（3-Aminophenylboric acid，APB）10 μL，D紙片上加EDTA和APB各10 μL。過夜孵育后量取抑菌圈直徑，如B紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，即可判斷該受試菌產(chǎn)B類碳青霉烯酶；如C紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，可判斷該受試菌產(chǎn)A類碳青霉烯酶；如僅D紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，可判斷該受試菌同時產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶；如B、C和D紙片均比A紙片的抑菌圈＜5 mm，則判斷受試菌不產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌（ ATCC BAA-1705）、（ATCC BAA-1706）和（ATCC BAA-2146）。

1.3.4 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測KPC、NDM、OXA-48耐藥基因，通過測序?qū)﹃栃詳U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)。 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]選取blaKPC、blaNDM和blaOXA-48的引物、PCR反應(yīng)體系和條件，引物由生工生物工程（上海）技術(shù)有限公司合成并測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。以PCR結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較2種方法鑒定不同碳青霉烯酶的效能。采用Kappa檢驗評價2種方法與PCR方法的一致性，Kappa值＜0.4表示一致性較差；0.4＜Kappa值≤0.8表示一致性較好；Kappa值＞0.8表示一致性極好。

2 結(jié)果

2.1 體外藥物敏感性試驗結(jié)果

CRE對黏菌素、替加環(huán)素、頭孢他啶-阿維巴坦、阿米卡星和磺胺甲噁唑-甲氧芐啶的耐藥率較低，分別為0%、2.3%、13.0%、50.4%、55.7%，對其他常用抗菌藥物的耐藥率均＞75%。

2.2 碳青霉烯類的耐藥基因分布

100株CRE中，檢出71株產(chǎn)KPC-2，23株產(chǎn)NDM-1，4株產(chǎn)NDM-5，1株產(chǎn)KPC-3，1株同時產(chǎn)KPC-2和NDM-1。72株肺炎克雷伯菌中，有70株僅產(chǎn)KPC-2。18株大腸埃希菌中，有13株產(chǎn)NDM-1，其中4株同時產(chǎn)KPC-2和NDM-1。見表1。

表1 100株CRE耐藥基因分布 株

2.3 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗結(jié)果

以PCR結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對于72株產(chǎn)A類絲氨酸酶的菌株，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗可準(zhǔn)確鑒定71株，敏感性為98.60%（71/72），特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.984。對于27株產(chǎn)B類金屬酶菌株和1株同時產(chǎn)A類絲氨酸酶和B類金屬酶的菌株，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗可全部準(zhǔn)確鑒定；與PCR比較，Kappa值分別為1.000和0.560。見表2、表3。

2.4 mCIM和eCIM結(jié)果

以PCR結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對于72株產(chǎn)A類碳青霉烯酶的菌株，mCIM/eCIM可準(zhǔn)確鑒定70株，其敏感性為97.22%，特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.969。對于27株產(chǎn)B類金屬酶菌株，mCIM和eCIM可準(zhǔn)確鑒定26株，敏感性為96.30%，特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.976。但mCIM和eCIM無法鑒定同時產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶的菌株。見表2、表3。

表2 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗與mCIM/eCIM結(jié)果比較 株

表3 2種方法檢測效能

3 討論

因為不同的抗菌藥物在體外對產(chǎn)不同類型碳青霉烯酶細(xì)菌的抗菌活性有差別，如頭孢他啶-阿維巴坦對產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株無抗菌活性[9]；美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-雷利巴坦對產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對金屬β-內(nèi)酰胺酶和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株無抗菌活性[9-11]。因此，準(zhǔn)確而快速地鑒定CRE碳青霉烯酶的型別，對于臨床合理選擇抗菌藥物治療多重耐藥菌的感染，降低患者死亡率，控制醫(yī)院內(nèi)感染和傳播流行具有重要的意義[8]。

由于細(xì)菌耐藥性具有遺傳復(fù)雜性，目前國際上檢測碳青霉烯酶的方法仍以表型方法檢測為主，而分子生物學(xué)方法通常作為篩選工具或作為傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充[9]。微生物實驗室用于檢測碳青霉烯酶的常用表型方法有Carba NP試驗、mCIM/eCIM、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗、激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜等。其中Carba NP試驗結(jié)果判斷主觀性較強(qiáng)，對操作人員要求較高，且試劑需自配，有效期短[12]；質(zhì)譜技術(shù)需要昂貴的質(zhì)譜儀，且目前缺乏統(tǒng)一可行的操作方法[13]。eCIM與/mCIM聯(lián)合使用可以區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌目細(xì)菌，成本低，操作簡單，結(jié)果易于解釋，適合大多數(shù)基層臨床實驗室開展。mCIM/eCIM聯(lián)合檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性＞95%、特異性＞92%[9]。本研究結(jié)果顯示，mCIM/eCIM檢測產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性為97.22%，特異性為100%；檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性為96.30%、特異性為100%，且與PCR結(jié)果的一致性較好，但eCIM的局限性是不能區(qū)分同時含有絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株。

有學(xué)者利用APB能抑制KPC型碳青霉烯酶的原理，建立了類似美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會定義的使用紙片擴(kuò)散法篩選產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的方法，用于檢測產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的腸桿菌目細(xì)菌[14]。TSAKRIS等[15]在DOI等的研究結(jié)果基礎(chǔ)上增加金屬β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑EDTA，用于檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶，這種雙碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗，不僅能區(qū)分金屬β-內(nèi)酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶，還能檢測同時產(chǎn)生2種碳青霉烯酶菌株，檢測單產(chǎn)KPC或金屬酶的敏感性均為100%，特異性分別為98.8%和100%。本研究結(jié)果顯示，碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗檢測單產(chǎn)KPC或金屬酶的敏感性分別為98.60%和100%，特異性均為100%，且和與PCR的一致性較好意，與DOI等[14]和TSAKRIS等[15]的研究結(jié)果一致。

2種方法各有局限：mCIM/eCIM檢測方法操作需要經(jīng)過4 h的孵育時間，操作步驟較碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗繁瑣，且該檢測方法不能區(qū)分同時產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株。碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗需要實驗室添置額外的試劑（如APB），成本較mCIM/eCIM高。

綜上所述，隨著CRE對抗菌藥物耐藥形勢日趨嚴(yán)峻，加強(qiáng)臨床微生物檢測能力，快速檢出耐藥菌株，是防控CRE的關(guān)鍵[16]。mCIM/eCIM和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶敏感性和特異性均超過95%，且成本較低，不同級別，尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床微生物實驗室可以根據(jù)自身需求來選擇適合本實驗室的方法進(jìn)行常規(guī)的CRE表型分型檢測。