胡 堯， 岑 屹， 張步月， 吳文清， 程 偉， 黃銘穎， 劉愛平， 關(guān) 明

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves'disease，GD）是一種自身免疫性甲狀腺功能亢進(jìn)疾病，通常累及眼、皮膚、骨骼和心臟[1]。促甲狀腺激素受體自身抗體（thyroid-stimulating hormone receptor antibody，TRAb）是GD診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物[2]。TRAb可分為3類：中性TRAb、抑制性TRAb和刺激性TRAb。刺激性TRAb即促甲狀腺免疫球蛋白（thyroid-stimulating immunoglobulin，TSI）[3]。根據(jù)TRAb的功能特點(diǎn)，TSI與促甲狀腺激素受體α-亞基上富含亮氨酸的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，能激活甲狀腺細(xì)胞持續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。因此，特異性檢測TSI水平對GD的準(zhǔn)確診斷具有重要意義。目前，TRAb的常規(guī)檢測方法是基于單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光免疫測定法，靈敏度較高，臨床應(yīng)用廣泛，但該方法不能區(qū)分不同類型的TRAb[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法可特異性檢測TSI[6]。為此，本研究擬在評價(jià)雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測性能的基礎(chǔ)上探討TSI在GD診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年10月—2021年1月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院GD患者126例（GD組），其中男31例、女95例，年齡（37.2±13.2）歲，包括初診患者41例、復(fù)診患者85例。另選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院其他甲狀腺疾病患者393例（對照組），其中男140例、女253例，年齡（42.1±16.0）歲，包括橋本甲狀腺炎79例、甲狀腺結(jié)節(jié)103例、甲狀腺功能減退癥96例、無毒性甲狀腺腫59例、甲狀腺囊腫56例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 方法溯源性 采用IMMULITE 2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國西門子公司）及配套試劑（雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法）檢測TSI；該方法溯源至世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）第2代促甲狀腺受體抗體國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[由英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品研究所（the National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）持有，代碼為08/240]。廠商提供的TSI參考區(qū)間為＜0.55 IU/L。采用cobas 8000 e 801 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測TRAb；該方法溯源至NIBSC第1代國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)90/672。廠商提供的參考區(qū)間為＜1.75 IU/L。TSI和TRAb的參考區(qū)間均經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)室所在地區(qū)人群驗(yàn)證通過。

1.2.2 精密度驗(yàn)證 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3文件[7]要求，分別采用雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法檢測2個(gè)水平的患者混合血清，每個(gè)水平重復(fù)測定5次，連續(xù)測定5 d，評估2種方法的重復(fù)性[變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）]和總精密度（以CV表示），并與廠商聲明的性能指標(biāo)進(jìn)行比較。

1.2.3 線性范圍驗(yàn)證 根據(jù)CLSI EP06-A文件[8]，分別選取處于廠商聲明的檢測范圍內(nèi)的高、低水平臨床樣本各1份，將高水平樣本（H）與低水平樣本（L）按比例（L、3H+2L、2H+2L、2H+3L、H）進(jìn)行稀釋，得到5份系列稀釋樣本，每份樣本重復(fù)測定3次，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，得到一階、二階和三階多項(xiàng)式模型，對回歸方程每個(gè)非線性系數(shù)做t檢驗(yàn)，判斷非線性系數(shù)與“0”的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。要求任何確定為非線性的樣本非線性量均低于廠商建議的線性目標(biāo)（±15%或±0.5 IU/L）。

1.2.4 2種方法的相關(guān)性評價(jià) 根據(jù)CLSI EP9-A3文件[9]，采用Pearson相關(guān)分析評估TSI與TRAb的相關(guān)性。根據(jù)CLSI EP12-A2文件[10]，采用Bland-Altman一致性分析評估雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb的一致性。比較TSI和TRAb的定性結(jié)果，對結(jié)果不一致的患者，由臨床醫(yī)生結(jié)合病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和甲狀腺超聲結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。采用Kappa檢驗(yàn)評估GD組和對照組TSI與TRAb檢測結(jié)果的一致性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0軟件、MedCalc 18.2.1軟件和Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價(jià)TSI和TRAb診斷GD的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

采用雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測2個(gè)水平混合血清樣本中的TSI，分別為0.95和19.5 IU/L，s分別為0.036、0.683 IU/L，重復(fù)性分別為3.8%、3.5%，總精密度分別為4.1%、3.6%，均低于廠商聲明的重復(fù)性（4.8%、4.5%）和總精密度（5.8%、5.8%）。

采用電化學(xué)發(fā)光法檢測2個(gè)水平混合血清樣本中的TRAb，分別為1.5和21.0 IU/L，s分別為0.105、0.357 IU/L，重復(fù)性分別為7.0%、1.7%，總精密度分別為7.8%、2.0%，均低于廠商聲明的重復(fù)性（7.8%、2.0%）和總精密度（11.0%、2.6%）。

2.2 線性范圍驗(yàn)證

廠商聲明的TSI和TRAb的線性范圍分別為0.1～40.0和0.8～40.0 IU/L。線性評估結(jié)果顯示，TSI的線性范圍為0.33～8.50 IU/L，低值（0.27 IU/L）與理論值的偏差高于廠商聲明（±15%），缺乏線性，最佳擬合回歸曲線呈拋物線形，對非線性范圍進(jìn)行三階多項(xiàng)式非線性系數(shù)t檢驗(yàn)，最佳擬合回歸曲線呈線性，見圖1（a）。TRAb的線性范圍為1.0～38.9 IU/L，且呈三項(xiàng)式最佳擬合線性回歸，見圖1（b）。TSI和TRAb線性范圍的驗(yàn)證結(jié)果見表1。

圖1 線性范圍驗(yàn)證

表1 TSI與TRAb線性范圍驗(yàn)證

2.3 TSI與TRAb的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，TSI與TRAb呈正相關(guān)[Y=0.944 4X-0.668 3（r=0.930，P＜0.05）]。見圖2。

圖2 TSI與TRAb的相關(guān)性

2.4 TSI與TRAb的一致性分析

519例甲狀腺疾病患者中，TSI陽性228例（43.9%），TRAb陽性216例（41.6%）。Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，TSI與TRAb的一致性較好（Kappa=0.83）。見表2。

表2 TSI與TRAb定性結(jié)果比較 例（%）

TSI與TRAb的總符合率為91.5%，但有44例患者檢測結(jié)果不一致。查閱臨床病歷資料，發(fā)現(xiàn)在28例TSI陽性、TRAb陰性的患者中，有19例是服用甲巰咪唑治療的GD患者；在16例TSI陰性、TRAb陽性的患者中，有2例為GD患者；有8例臨床診斷為良性甲狀腺結(jié)節(jié)或甲狀腺囊腫，游離甲狀腺素水平正常；有6例臨床診斷為橋本甲狀腺炎。TSI檢測結(jié)果與臨床診斷的總體符合率為95.7%（497/519）。TRAb檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的總體符合率為93.4%（485/519）。

GD組TSI和TRAb水平分別為5.25（1.75～17.10）和6.86（3.25～20.30）IU/L，對照組分別為0.80（0.80～1.88）、0.10（0.10～1.20）IU/L。Bland-Altman一致性分析結(jié)果顯示，對于GD組，雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb的平均偏差為1.5 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比為4%；對于對照組，2種方法的平均偏差為0.8 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比為4%。見圖3。

圖3 雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb的Bland-Altman一致性分析

2.5 TSI和TRAb鑒別診斷GD的效能

剔除治療后GD患者數(shù)據(jù)，采用ROC曲線分析TSI和TRAb鑒別診斷GD的效能。結(jié)果顯示，TSI診斷GD的曲線下面積（area under curve，AUC）（95%CI）為0.89（0.86～0.91），最佳臨界值為0.7 IU/L，敏感性為93.7%，特異性為85.1%，陽性預(yù)測值為94.0%，陰性預(yù)測值為86.0%；TRAb診斷GD的AUC（95%CI）為0.86（0.83～0.89），最佳臨界值為2.5 IU/L，敏感性為92.5%，特異性為86.7%，陽性預(yù)測值為92.0%，陰性預(yù)測值為85.0%。見圖4。

圖4 TSI和TRAb診斷GD的ROC曲線

3 討論

GD是甲狀腺功能亢進(jìn)最常見的病因，GD的診斷通?；诩谞钕俟δ芸哼M(jìn)的臨床特征，包括心悸和怕熱出汗，以及GD的明顯特征，如眼眶病變和甲狀腺肢端肥大。根據(jù)GD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，TRAb是一個(gè)有效的檢測指標(biāo)，且應(yīng)與甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸和促甲狀腺激素聯(lián)合檢測[12]。以往放免法檢測的TRAb僅能反映GD患者體內(nèi)存在針對促甲狀腺激素受體的自身抗體，不能反映這種抗體的功能，隨著TRAb檢測的敏感性和特異性的不斷改善，TRAb不僅可以用于GD患者治療效果的評估，還可用于GD的篩查[13]。

本研究結(jié)果顯示，在精密度方面，雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI較電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb表現(xiàn)出更好的性能。在線性驗(yàn)證中，2種方法呈相似的低值高偏差的非線性，隨著分析物濃度的增加，出現(xiàn)拋物線線性反應(yīng)，三項(xiàng)式曲線是其最佳擬合模型，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致。原因可能是TRAb屬于自身抗體，具有異質(zhì)性，在體外會(huì)產(chǎn)生低值非線性的稀釋現(xiàn)象。雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb之間呈高度正相關(guān)（r=0.930）。這是因?yàn)殡娀瘜W(xué)發(fā)光法溯源至第1代國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NIBSC代碼：90/672），可檢測所有類型的TRAb；而雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法溯源至第2代國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NIBSC代碼：08/240），可特異性檢測TSI。根據(jù)廠商聲明的參考區(qū)間判斷，2種方法的總符合率為91.5%。

有研究結(jié)果顯示，對于未經(jīng)治療的GD患者，TSI檢測結(jié)果與TRAb檢測結(jié)果之間一致性較好，但TSI對GD的診斷準(zhǔn)確性更高[15-16]。TRAb檢測的主要問題是慢性甲狀腺炎伴甲狀腺功能減退患者可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，其原因可能與這些患者體內(nèi)存在中性TRAb或抑制性TRAb有關(guān)。TOZZOLI等[6]的研究結(jié)果顯示，橋本甲狀腺炎患者TRAb會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，假陽性率為3.6%。本研究結(jié)果顯示，在2種方法檢測結(jié)果不一致的44例患者中，6例橋本甲狀腺炎患者的TSI結(jié)果均為陰性，Bland-Altman一致性分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[6，17]一致。因此，TSI在鑒別GD與橋本甲狀腺炎時(shí)更具特異性。一項(xiàng)多中心研究結(jié)果顯示，雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI的結(jié)果與TSI生物法測定結(jié)果的一致性更高，TSI可作為我國GD患者的診斷指標(biāo)之一，建議與TRAb檢測聯(lián)合應(yīng)用，以提高診斷的準(zhǔn)確性；并建議建立不同地區(qū)人群相應(yīng)的TRAb或TSI醫(yī)學(xué)決定水平參考區(qū)間，以達(dá)到最佳的GD臨床診斷性能[18]。由于人群、地區(qū)等的差異，不同研究中雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb的敏感性和特異性可能存在一定的差異。張利霞等[19]對1 367例甲狀腺疾病患者的研究結(jié)果顯示，臨床甲狀腺功能減退組、亞臨床甲狀腺功能減退組TSI陽性率高于正常對照組，說明除GD患者會(huì)出現(xiàn)TSI陽性外，其他甲狀腺疾病患者也會(huì)出現(xiàn)TSI陽性。鐘麗等[20]的研究結(jié)果顯示，TSI輔助診斷GD的敏感性為89.0%，特異性為94.7%。劉天琪等[21]采用與本研究相同的方法分別檢測了48例甲狀腺相關(guān)性眼病患者的TSI和TRAb，2個(gè)項(xiàng)目定性結(jié)果的符合率為89.5%。

綜上所述，雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光法檢測TSI具有可靠的分析性能，且與電化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb具有良好的相關(guān)性。TSI定量檢測有助于提高臨床對GD的診斷效率。