唐 濤，王帆帆，郭 杰，郭曉亮，段媛媛，游景茂

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000）

白術(shù)（AtractylodesmacrocephalaKoidz.）屬菊科草本植物，名列中醫(yī)四大名貴藥材之一，主要以干燥根莖入藥，具有止汗、安胎、健脾益氣的功效，臨床上常用于治療痰飲眩悸、脾虛食少、腹脹泄瀉等［1］。湖北省恩施土家族苗族自治州（簡稱恩施州）是白術(shù)的主產(chǎn)區(qū)之一，有悠久的種植歷史，咸豐“雞腿白術(shù)”2007年入選中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著白術(shù)種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，白術(shù)根腐病在恩施州呈暴發(fā)趨勢，嚴(yán)重威脅白術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展［2］。前人報(bào)道白術(shù)根腐病致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）、半裸鐮刀菌（Fusariumsemitectum）、茄病鐮刀菌（Fusariumsolani）和齊整小核菌（Sclerotiumrolfsii）等［3，4］。You等［5］研究報(bào)道湖北省恩施州白術(shù)根腐病致病菌主要為角擔(dān)菌（Ceratobasidiumsp.），并在白術(shù)內(nèi)篩選出生防菌枯草芽孢桿菌BZJN1。比較生防菌BZJN1與化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑的防治效果發(fā)現(xiàn)，生防菌BZJN1在濃度為1×109CFU/mL時(shí)的防治效果超過75.27%，與30%苯甲·丙環(huán)唑推薦劑量防治效果相當(dāng)［6］。中藥材種植過程中的病蟲害防治，不僅要保證有害生物得到有效控制，還需兼顧藥材品質(zhì)和自然環(huán)境安全，因此生物防治是中藥材病蟲害防治的最佳選擇。土壤微生物是重要的土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)之一，對維持土壤生命力，保障農(nóng)作物正常生長具有重要意義［7］。土壤微生物數(shù)量能夠一定程度上反映土壤的綜合生態(tài)環(huán)境特征，土壤微生物多樣性是研究土壤生態(tài)功能和土壤生態(tài)平衡的關(guān)鍵［8］。本研究比較了生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑?qū)Π仔g(shù)根際土壤真菌結(jié)構(gòu)的影響，以期為更好地推廣應(yīng)用生防菌BZJN1提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物為咸豐“雞腿白術(shù)”；供試菌株為BZJN1，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材所植物保護(hù)室分離鑒定保存；化學(xué)藥劑為30%苯甲·丙環(huán)唑乳油，購自湖南綠葉化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣 試驗(yàn)點(diǎn)位于湖北省恩施州咸豐縣小村鄉(xiāng)白術(shù)試驗(yàn)田。試驗(yàn)田前茬作物為白術(shù)，從上年發(fā)生根腐病的白術(shù)上分離的致病菌主要為角擔(dān)菌，種植過程中各項(xiàng)操作均一致，不使用其他化學(xué)藥劑。選擇一年生大小均一的白術(shù)根莖移栽，栽種前將BZJN1的發(fā)酵原液稀釋為1×109CFU/mL作為處理組（BZJN1），以化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑2 000倍稀釋液為陽性對照（HX），清水處理為陰性對照組（CK）。按照上述各藥劑濃度浸種30 min，晾干后種植。試驗(yàn)設(shè)置每小區(qū)面積為15 m2，10株/m2，共150株，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。種植1個(gè)月后，2013年4月20日按照各藥劑推薦濃度灌根，每株約50 mL，施用3次，間隔7 d。末次施藥30 d后采用5點(diǎn)取樣的方法收集白術(shù)根際中層土壤，利用土壤取樣器打取地表下5～10 cm的土壤，將5點(diǎn)樣品均勻混合收集備用。

1.2.2 土壤微生物基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增 采用MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取白術(shù)根際土壤微生物總DNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性和片段大小，以引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò) 增 真 菌ITS全長，將經(jīng)過檢測后的擴(kuò)增產(chǎn)物委托給上海派森諾生物科技有限公司，對其進(jìn)行高通量測序（Illumina公司MiSeq測序儀）。

1.2.3 測序文庫的制備 采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。首先對上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列末端修復(fù)，通過試劑盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出堿基，同時(shí)添加一個(gè)磷酸基團(tuán)、補(bǔ)齊3′端的缺失堿基。在DNA序列的3′端添加A堿基以防止DNA片段自連，同時(shí)保證目標(biāo)序列能與測序接頭相連（測序接頭3′端有一個(gè)突出的T堿基）。然后在序列5′端添加含有文庫特異性標(biāo)簽（即Index序列）的測序接頭，使DNA分子能被固定在Flow Cell上，采用BECKMAN AMPure XPBeads，通過磁珠篩選去除接頭自連片段，純化添加接頭后的文庫體系。最后，對上述連上接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而富集測序文庫模板，并采用BECKMAN AMPure XPBeads再次純化文庫富集產(chǎn)物，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對文庫做最終的片段選擇與純化。

1.2.4 上機(jī)高通量測序 上機(jī)測序前，需要先對文庫在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit。合格的文庫只有單一的峰，且無接頭。之后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，合格的文庫濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。將合格的各上機(jī)測序文庫（Index序列不可重復(fù)）梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序。使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3（600個(gè)循環(huán)）。

1.2.5 下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析 首先運(yùn)用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）識(shí)別疑問序列。除了要求序列長度≥150 bp，且不允許存在模糊堿基N之外，還需剔除：①5′端引物錯(cuò)配堿基數(shù)＞1的序列；②含有連續(xù)相同堿基數(shù)＞8的序列。隨后，通過QIIME軟件（v1.8.0，http：//qiime.org/）調(diào)用USEARCH（v5.2.236，http：//www.drive5.com/usearch/）檢查并剔除嵌合體序列，得到有效序列。分析真菌Alpha多樣性，其評價(jià)指標(biāo)主要包括Chao1、覆蓋度和Shannon指數(shù)等。其中，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)；覆蓋度是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低；Shannon指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一。

1.2.6 土壤理化和酶活性指標(biāo)測定 土壤速效養(yǎng)分含量直接關(guān)系到作物根系的吸收和生長以及作物產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，是評價(jià)土壤肥力高低的最常用指標(biāo)。土壤酶是土壤微生物、土壤中動(dòng)植物體分泌及動(dòng)植物尸體降解釋放在土壤中的一類具催化活性的物質(zhì)。其活性間接反映了土壤生物化學(xué)反應(yīng)的劇烈程度和營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)狀況，是土壤表征研究的重要指標(biāo)。比較BZJN1和化學(xué)藥劑對土壤理化性質(zhì)和酶活的影響，可以幫助理解BZJN1促生作用的機(jī)理。土壤理化指標(biāo)的測定均委托湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所測定。具體土壤理化指標(biāo)的測定方法：速效氮測定采用凱氏定氮儀法；速效磷測定采用Bray法；速效鉀測定采用醋酸銨-原子吸收光譜儀法；pH測定采用電位法。土壤中酶活性的測定方法：脲酶測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；過氧化氫酶測定采用雙氧水比色法；蔗糖酶測定采用甲苯-二硝基水楊酸比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用Prism 6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控和OTU聚類分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化處理后，發(fā)現(xiàn)9個(gè)樣本共測序獲得405 043條高質(zhì)量有效序列片段，單一樣本序列數(shù)為35 414～75 224條，序列平均長度254 bp（表1）。在97%的相似度水平下對樣品序列進(jìn)行OTU聚類分析，對照組3個(gè)樣本共鑒定得到真菌9個(gè)門19個(gè)綱59個(gè)目101個(gè)科182個(gè)屬308個(gè)種，959個(gè)OTU；施用生防菌BZJN1組3個(gè)樣本共鑒定得到真菌9個(gè)門21個(gè)綱65個(gè)目112個(gè)科193個(gè)屬310個(gè)種，1 117個(gè)OTU；施用化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑組3個(gè)樣本共鑒定得到真菌9個(gè)門22個(gè)綱63個(gè)目106個(gè)科179個(gè)屬292個(gè)種，855個(gè)OTU（表2）。

表1 不同樣品序列信息

表2 樣品中真菌群落各級(jí)別分類群的數(shù)量

2.2 不同處理對真菌群落α多樣性的影響

對比化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理和對照組樣品α多樣性指數(shù)，結(jié)果如表3所示，Chao1和ACE指數(shù)都是豐富度估計(jì)指數(shù)，相比于對照組，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理后Chao1和ACE指數(shù)均不存在顯著差異，這說明化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理對土壤真菌豐富度沒有顯著影響。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了物種的多樣性，Shannon和Simpson指數(shù)越大，則物種多樣性越高。相比于對照組，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理后Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均沒有顯著變化，說明在化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理后土壤真菌的物種多樣性不存在顯著差異。綜合來看，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理對土壤真菌沒有顯著影響。

表3 不同樣品的α多樣性指數(shù)

2.3 不同處理對土壤真菌組成的影響

利用RDP classifier對各樣品OTU從門到屬進(jìn)行分類，分析供試土壤樣品在各水平的真菌菌群結(jié)構(gòu)。從中選取各樣品在門、屬分類水平上排名靠前的菌群，生成相對豐度累加柱形圖。

對比化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理和對照組土壤樣品的真菌組成，整體來看，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理對土壤真菌組成沒有明顯影響，僅在部分菌門存在相對含量的細(xì)微差別。如圖1A所示，在門水平上，對照組土壤樣品中的主要真菌為子囊菌門（Ascomycota）76.34%＞擔(dān)子菌門（Basidiomycota）12.49%＞接合菌門（Zygomycota）3.11%＞羅茲 菌門（Rozellomycota）0.99%＞絲 足 蟲 門（Cercozoa）0.57%＞球 囊 菌 門（Glomeromycota）0.40%＞壺菌門（Chytridiomycota）0.14%。所有土壤樣品中的主要真菌為子囊菌門和擔(dān)子菌門，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理、生防菌BZJN1處理與對照組土壤樣品的真菌在組成上沒有差異，僅在相對豐度上有細(xì)微差別。

在屬水平上，對照組土壤樣品中共檢測到真菌182個(gè)屬，其中種類繁雜、豐富度較低的稀有真菌類群（＜1%）為主要菌群，占全部菌群50%以上，說明土壤中存在大量有待發(fā)掘的未知微生物資源。已明確分類地位的相對豐度排前十的真菌菌屬為莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、隱球菌屬（Cryptococcus）、大孢圓孢霉屬（Staphylotrichum）、被孢霉屬（Mortierella）、Ilyonectria、毛殼菌屬（Chaetomium）、硬皮馬勃屬（Scleroderma）、木霉屬（Trichoderma）、淡領(lǐng)瓶霉屬（Cadophora）和Cladophialophora（圖1B）。

圖1 不同樣品在門（A）和屬（B）水平上的真菌組成

2.4 不同處理土壤樣品真菌群落差異性分析

進(jìn)一步探究各處理土壤樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，采用STAMP軟件分析對照組與BZJN1處理組和化學(xué)藥劑處理組真菌結(jié)構(gòu)在門水平上的差異。如圖2A所示，對照組和BZJN1處理組共有4個(gè)門類真菌，二者之間相對豐度存在顯著性差異（P＜0.05），其中，擔(dān)子菌門、接合菌門和壺菌門在對照組的相對豐度顯著低于BZJN1處理組，子囊菌門在對照組的相對豐度顯著高于BZJN1處理組。如圖2B所示，對照組和化學(xué)藥劑處理組共有5個(gè)門類真菌相對豐度存在顯著性差異（P＜0.05），其中，擔(dān)子菌門、壺菌門和羅茲菌門在對照組的相對豐度顯著低于化學(xué)藥劑處理組，子囊菌門和絲足蟲門在對照組的相對豐度顯著高于化學(xué)藥劑處理組。

圖2 不同樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的差異分析

屬水平的真菌多樣性豐度如圖3所示，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑、生防菌BZJN1和對照組的白術(shù)根際土壤微生物菌屬的相對豐度差異較大。莖點(diǎn)霉屬、木霉屬、德福霉屬（Devriesia）、節(jié)枝孢屬（Articulospora）、蛙糞霉屬（Basidiobolus）、青霉菌屬（Penicillium）和大孢圓孢霉屬在對照組土壤中的相對豐度明顯高于其他兩組；被孢霉屬、毛殼菌屬、布勒擲孢酵母屬（Bullera）和木霉屬的相對豐度在BZJN1處理組中最高；而Ilyonectria、硬皮馬勃屬、淡領(lǐng)瓶霉屬、Cladophialophora和隱球菌屬的相對豐度在化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理組土壤中明顯高于生防菌BZJN1和對照組?；瘜W(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑和生防菌BZJN1處理對白術(shù)根際土壤微生物菌屬組成影響較大，部分菌屬豐度減少，部分菌屬豐度上升。但造成這種影響的具體機(jī)制以及這種變化對土壤及白術(shù)生長的具體影響均不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

圖3 不同樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的差異分析

2.5 真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

利用冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析真菌10個(gè)屬主要差異菌群與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系。結(jié)果如圖4所示，白術(shù)根際土壤pH、速效鉀（AK）和過氧化氫酶與土壤真菌硬皮馬勃屬、淡領(lǐng)瓶霉屬、Cladophialophora和Ilyonectria呈顯著正相關(guān)，與大孢圓孢霉屬呈顯著負(fù)相關(guān)。被孢霉屬、毛殼菌屬與根際土壤蔗糖酶和脲酶呈顯著正相關(guān)，莖點(diǎn)霉屬與根際土壤速效氮（AN）呈顯著正相關(guān)。

圖4 真菌群落與環(huán)境因子的RDA分析

由表4可知，化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理和生防菌BZJN1處理與對照組土壤樣品的pH、速效氮、速效磷、速效鉀和過氧化氫酶活性均沒有顯著差異，這說明生防菌BZJN1處理和化學(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理對土壤pH、速效氮、速效磷、速效鉀和過氧化氫酶活性沒有顯著影響?；瘜W(xué)藥劑苯甲·丙環(huán)唑處理后土壤中脲酶活力顯著上升，而生防菌BZJN1處理后土壤中蔗糖酶活力和脲酶活力均顯著上升，表明生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑處理后均能顯著提升部分土壤酶活性，可能對土壤化學(xué)反應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)有一定的促進(jìn)作用。

表4 樣本土壤環(huán)境理化因子

3 小結(jié)與討論

生防菌BZJN1處理組檢測出的真菌物種略多于對照組，而施用化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油處理組檢測出的真菌物種略少于對照組。病害的發(fā)生與植株各部位微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，微生物群落結(jié)構(gòu)健康穩(wěn)定，即病原菌少，有益菌多，微生物多樣性高，能夠一定程度上阻止或延緩病害的侵染［9］。施用生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油防治白術(shù)根腐病的防效相當(dāng)［6］，但就長遠(yuǎn)的影響來看，施用化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油會(huì)逐漸減少根際土壤真菌群落多樣性，從而破壞根際土壤中真菌群落的生態(tài)平衡，引發(fā)更嚴(yán)重的作物病害。施用生防菌BZJN1能使根際土壤真菌群落多樣性逐漸增加，有利于根際土壤微生物的生態(tài)平衡。有研究表明，利用有益微生物能顯著降低作物連作障礙，對作物病害防治有突出效果［10］，有益微生物對根際土壤微生物的影響可能在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Alpha多樣性分析表明，施用生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性并沒有顯著影響，但各真菌組成相對豐度差異十分明顯。白術(shù)根際土壤樣品中的主要真菌為子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門，這一結(jié)果與謝玉清等［11］檢測的大蒜根腐病發(fā)生后根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似。施用生防菌BZJN1后，白術(shù)根際土壤中擔(dān)子菌門、接合菌門和壺菌門相對豐度顯著提升，宋旭紅等［12］發(fā)現(xiàn)感染根腐病后黃連根際土壤中子囊菌門和壺菌門的相對豐度顯著高于健株土壤，這與本研究結(jié)果相悖，可能與研究對象及致病菌的差異有關(guān)。在屬水平上，白術(shù)根際土壤真菌群落的優(yōu)勢菌屬為莖點(diǎn)霉屬和隱球菌屬，這一結(jié)果與向立剛等［13］測定煙柱及唐彬彬等［14］測定三七根際土壤真菌結(jié)構(gòu)存在差異。施用生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油處理組和對照組均有相對豐度占優(yōu)的菌屬，這說明施用生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油對白術(shù)根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)存在明顯影響。微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性受多種因素影響，包括氣候條件、土壤類型、人類活動(dòng)以及營養(yǎng)條件等［15］。本研究所取樣品均來自大田，即使同一塊田地每株植物的生長環(huán)境也不盡相同，因此導(dǎo)致本研究中同類樣本組內(nèi)差異較大。雖然同組樣本存在一定差異，但各處理組真菌群落的總體變化趨勢一致，能夠反映田間施用生防菌BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油對白術(shù)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響情況。前期研究發(fā)現(xiàn)施用生防菌劑BZJN1和化學(xué)藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑乳油對白術(shù)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響不大，但生防菌BZJN1對白術(shù)根際土壤細(xì)菌群落存在一定有利影響［16］。而本研究中施用生防菌BZJN1對白術(shù)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性也有一定促進(jìn)作用，這一結(jié)果為生防菌BZJN1的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了參考依據(jù)。