孫欣怡 周建慶 廉姜芳

冠心病是導致當前全球范圍內(nèi)心血管事件發(fā)生的主要原因，發(fā)病率仍在逐年上升。動脈粥樣硬化的發(fā)展主要包括內(nèi)皮細胞損傷、脂蛋白沉積、炎癥和纖維帽形成，是冠心病發(fā)生的基礎環(huán)節(jié)，但其分子機制極其復雜，至今尚未完全闡明。20世紀60年代，有學者在對雞胚進行研究時發(fā)現(xiàn)，上皮細胞可以轉(zhuǎn)化為肌樣或成纖維細胞樣表型細胞，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[1]。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelium-mesenchymal transition，EndMT）作為EMT的一種亞型日益受到臨床關注。越來越多的研究證實EndMT可促進動脈粥樣硬化發(fā)展[2-3]，這為明確冠心病的發(fā)病機制和發(fā)展過程提供了新證據(jù)。本文對EndMT在動脈粥樣硬化中的機制、作用的研究進展作一綜述。

1 調(diào)節(jié)EndMT的信號通路

EndMT是指在病理和生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞發(fā)生形態(tài)和功能紊亂，遷移能力增加，細胞外基質(zhì)蛋白分泌增加，并逐漸喪失緊密連接的特征，同時血小板黏附分子31（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等內(nèi)皮細胞相關蛋白表達水平下調(diào)；α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌細胞22α（smooth muscle cell 22α，SM22α）等間質(zhì)細胞相關蛋白表達水平上調(diào)，逐漸完成內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程[3-4]。

EndMT可通過多種生化和生物力學信號通路被激活，如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）信號通路、Notch信號通路等，其中占據(jù)核心地位的是TGF-β信號通路。

1.1 TGF-β信號通路TGF-β是一種多功能蛋白，在卵巢閉鎖、腎臟纖維化、腫瘤生長、非酒精性肝病和炎癥反應調(diào)節(jié)中顯示出功能高度多樣化[5-8]。在內(nèi)皮細胞中，TGF-β通過Ⅱ型受體和Ⅰ型受體復合物發(fā)出經(jīng)典信號。隨后TGF-β與受體復合物在細胞表面結合，形成活性復合物，并通過Smad1、2、3、5的依次活化在細胞內(nèi)完成信號傳遞，最后與Smad 4結合穿梭入細胞核中，當他們與核內(nèi)輔助激活因子、輔助抑制因子和附加轉(zhuǎn)錄因子相互作用時，可引起細胞染色質(zhì)重排，最終導致EndMT發(fā)生[9-10]。TGF-β可被單獨用作EndMT的刺激物，或與其他促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）聯(lián)合使用，以研究各種疾病模型中炎癥對EndMT的影響。

1.2 BMP信號通路BMP屬于TGF-β信號通路超家族，迄今，超過20個不同功能的BMP已被確定[11]，TGF-β/BMP信號的串擾也已被證實[12]。BMP配體與受體相互作用誘導Smad1、5、8磷酸化，介導下游信號傳導[13]。BMP分別與兩種不同受體結合，通過Smad依賴和非Smad依賴的途徑介導信號轉(zhuǎn)導[14]。研究證實，在促炎誘導的EndMT中，BMPⅡ型受體下調(diào)，BMP9誘導的成骨分化和鈣化增強，導致c-Jun氨基末端激酶信號通路被抑制，促進血管鈣化[15]。有研究表明BMPⅡ型受體在內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮保護作用，特別是其可通過調(diào)節(jié)BMP/TGF-β信號來保護細胞，減少內(nèi)皮細胞對TGF-β反應[16]。除了BMPⅡ型受體，BMP6也具有誘導成骨分化及鈣化的能力?；钚匝趸罨荁MP6調(diào)節(jié)成骨基因、成骨分化和鈣化的必需環(huán)節(jié)[17]。此外，Zhu等[18]發(fā)現(xiàn)大腦和肌肉arnt樣蛋白-1可通過BMP信號通路抑制活性氧誘導的EndMT，從而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。

1.3 Notch信號通路Notch信號通路在生物進化中高度保守，表現(xiàn)為通過局部細胞間相互作用調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡等[19]。Lin等[20]已證實，Notch信號通路激活可誘導EndMT的進展并促進動脈粥樣硬化病變發(fā)展。Notch配體Delta4和Notch受體1、2、3、4在房室管和流出道心臟細胞上的表達可在整個EndMT進程中發(fā)揮作用。當細胞膜上的Notch受體1與配體結合，蛋白酶發(fā)生裂解，釋放出Notch1細胞內(nèi)結構域，遷移至細胞核內(nèi)，充當轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，激活或抑制定義細胞特性的基因。Notch1信號通過在心肌上表達的配體Jagged1，抑制BMP介導的EndMT[21]。Chang等[22]證實，Notch蛋白可誘導激活素A促進內(nèi)皮細胞通過磷酸肌醇3激酶（phosphatidylionsitol 3-kinase，PI3K）/Akt途徑分泌一氧化氮，一氧化氮與其受體鳥苷酸環(huán)化酶相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。在此過程中，Notch信號通路也可與TGF-β信號通路協(xié)同，在Notch信號激活時，釋放可溶性Notch1細胞內(nèi)結構域，上調(diào)Smad3相關tRNA，激活Smad依賴型信號傳導通路，從兩條途徑上共同促進EndMT。在體外實驗中，Notch信號通路通過增加VE-cad和α-SMA表達誘導EndMT，而γ分泌酶抑制劑可通過抑制Notch信號通路延緩動脈粥樣硬化病變的發(fā)展[20]。Lin等[20]認為Notch信號通路的激活可誘導EndMT的進展，促進動脈粥樣硬化病變發(fā)展。

1.4 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可激活細胞核內(nèi)靶基因的表達，并通過抑制糖原合成酶激酶3β介導的磷酸化作用以及抑制胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白降解誘發(fā)EndMT。β-連環(huán)蛋白在細胞內(nèi)大量累積后會轉(zhuǎn)移進入細胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子亞單位誘導EndMT相關基因表達，從基因水平促進EndMT。Lee等[23]表明，Wnt-3a在瘢痕發(fā)病機制中誘導EndMT，Wnt-3a可顯著降低VE-cad mRNA表達水平，誘導間質(zhì)細胞標志物在人真皮微血管內(nèi)皮細胞中的表達上調(diào)。

1.5 其他EndMT相關信號通路 除了經(jīng)典的TGF-β信號通路、BMP信號通路、Notch信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路外，還有多種信號通路介導了EndMT的作用。Medici等[24]研究證明,促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路、PI3K/Akt激酶信號通路、p38絲裂原激活的蛋白激酶信號通路和抑制性微小RNA（microRNA，miRNA）等，可與TGF-β信號通路相互作用，由TGF-β信號系統(tǒng)整合這些途徑，上調(diào)Snail轉(zhuǎn)錄因子表達水平，誘導EndMT的發(fā)展[25]。TGFβ3也可通過Rho激酶和活化素受體樣激酶2，誘導EndMT[26]。

2 影響EndMT發(fā)生的因素

2.1 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）TGF-β途徑上游的FGF可抑制TGF-β介導的內(nèi)皮細胞標志物表達。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)FGF受體1是抑制內(nèi)皮細胞TGF-β信號轉(zhuǎn)導的關鍵，F(xiàn)GF受體1豐度降低可促進EndMT和廣泛血管病變。連接FGF受體與MAPK的銜接蛋白FRS2可在人臍動脈內(nèi)皮細胞中誘導內(nèi)皮細胞凋亡，表現(xiàn)為內(nèi)皮凋亡相關基因、平滑肌細胞重構相關基因上調(diào)。Chen等[28]證實在體外小鼠模型中敲除FRS2后，小鼠主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈和主動脈根部動脈粥樣硬化病變數(shù)量增加。高脂飲食16周后，F(xiàn)RS2敲除小鼠的動脈粥樣硬化病變進一步增加，斑塊負荷增加84%。此外，炎性細胞因子，如干擾素-γ、TNF-α和IL-1β，可下調(diào)FGF受體1，使內(nèi)皮細胞對FGF信號的反應性降低，促進EndMT。從目前的研究來看，干預FGF介導的TGF-β信號通路是控制EndMT失衡的有效靶點。

2.2缺氧和缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）HIF是一種轉(zhuǎn)錄因子，是氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，作為細胞的穩(wěn)定成分，可在低氧狀態(tài)下被激活和誘導，靶向調(diào)節(jié)下游基因來介導機體各項生命活動。已有研究發(fā)現(xiàn)HIF下游基因與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是缺血性腦卒中密切相關[29]。體內(nèi)環(huán)境中，HIF-1α在動脈粥樣硬化小鼠主動脈弓中表達增加，與斑塊負荷最高的區(qū)域重疊，同時，具有EndMT標志物的缺氧細胞數(shù)量顯著增加。體外環(huán)境中，免疫熒光實驗顯示缺氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞表型與TGF-β誘導EndMT效果一致。流式細胞檢測也證實缺氧可增加內(nèi)皮細胞間質(zhì)標志物Sca1蛋白、EndMT標志物Snai1、a-SMA和TGF-β1的mRNA水平。對動脈粥樣硬化主動脈中具有EndMT表型的單個細胞進行缺氧檢測也證實，缺氧是EndMT的重要因素[30]。斑塊破裂導致血栓栓塞是心肌梗死的主要原因，與動脈斑塊中的新生血管生成有關。研究表明，HIF-1通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子促進缺血損傷組織中的血管生成和新生血管形成，最終導致斑塊進展、出血和潰瘍[31-32]。此外，缺氧條件可誘導心臟微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化。乙酰膽堿可降低缺氧條件下HIF-1α蛋白表達水平，抑制NF-κB活化及誘導自噬來抑制缺氧導致的EndMT，從而延緩動脈粥樣硬化進展[33]。

2.3 剪切應力和機械傳感器 剪切應力對內(nèi)皮細胞有調(diào)節(jié)作用。由于冠狀動脈的解剖形態(tài)特征，在降主動脈處血流剪切應力較高且方向一致，血流表現(xiàn)為穩(wěn)定流，穩(wěn)定流有動脈粥樣硬化保護作用，相反，在主動脈弓處血流剪切應力較降主動脈處下降且方向改變，血流表現(xiàn)為擾動流，擾動流主要發(fā)生在主動脈弓小彎處，能夠促進動脈粥樣硬化，主要特點是低震蕩切應力。Andueza等[34]通過對暴露于擾動流中的內(nèi)皮細胞進行單細胞RNA測序，證明內(nèi)皮細胞有高度異質(zhì)性和可塑性。低震蕩切應力誘導內(nèi)皮細胞從動脈粥樣硬化保護表型轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺准毎?、間質(zhì)細胞、造血干細胞、內(nèi)皮干細胞和內(nèi)皮源性免疫細胞樣表型。研究證實，非選擇性的陽離子通道Piezo1可作為機械傳感器針對穩(wěn)定流和擾動流分別進行對應調(diào)節(jié)[35]，Piezo1首先觸發(fā)相同的鈣內(nèi)流形成初始機械信號傳導，進而激活內(nèi)皮反應。在穩(wěn)定流條件下，Piezo1激活參與抑制動脈粥樣硬化的PI3K/eNOS通路。在擾動流條件下，Piezo1激活NF-κB通路以促進炎癥反應及動脈粥樣硬化[36]。因為NF-κB通路是已知的炎癥介導EndMT的通路[37]，因此Piezo1可能在調(diào)節(jié)擾動流誘導的EndMT中發(fā)揮了重要的機械感覺作用。此外，機械傳感器激活素受體樣激酶5（activin receptor-like kinase 5，Alk5）是調(diào)節(jié)擾動流誘導的EndMT至關重要的受體。Alk5及其相關蛋白Shc與Smad2介導的EndMT通路激活直接相關[38]。叢蛋白D1也被確定為促進動脈粥樣硬化的剪切應力的機械傳感器[39]。內(nèi)皮細胞對擾動流反映的可塑性表明，動脈粥樣硬化斑塊的進展可能涉及多種細胞類型及機械感受器之間的復雜作用，了解、控制內(nèi)皮細胞生理病理變化過程，確定在不同血流狀態(tài)中內(nèi)皮細胞激活的過渡類型，可能是開發(fā)動脈粥樣硬化靶向治療方法的重要考慮因素。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子和miRNA Snail、Twist是EndMT發(fā)生的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，均在引起動脈粥樣硬化的低穩(wěn)態(tài)切應力部位表達較多。Snail可通過促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移來增強內(nèi)皮對大分子的滲透性。激活Snail可引起α-SMA、SM22a等間質(zhì)標志物表達上調(diào)，因此可能有助于血管損傷和動脈粥樣硬化的形成[40]。但也有研究證實,Snail過度表達不能直接導致EndMT,但抑制Snail表達可防止TGF-β2誘導的EndMT[41]。Twist決定細胞譜系在發(fā)育過程中的最終分化狀態(tài)，對細胞形態(tài)變化起重要作用，有Twist1、Twist2兩種分型。Twist1可誘導內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進發(fā)育性血管生成，并通過誘導炎癥來促進動脈粥樣硬化[42]。在腎損傷小鼠模型中，將內(nèi)皮細胞中Twist1特異性刪除，可顯著抑制EndMT的出現(xiàn)，改善腎臟纖維化[43]。

此外，微小RNA是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關鍵調(diào)控因子，可通過靶向定位轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控與EndMT誘導相關的信號通路來激活或抑制EndMT。研究證實，miR-122在載脂蛋白E基因敲除小鼠和體外EndMT模型中均呈高表達，在載脂蛋白E基因敲除小鼠中抑制miR-122可以減少斑塊形成[44]。同樣，抑制miR-122可逆轉(zhuǎn)過氧化氫誘導的EndMT。miR-122可以通過轉(zhuǎn)錄因子NPAS3介導的EndMT促進斑塊形成，并可能成為治療動脈粥樣硬化的新靶點[44]。LINC00657通過miRNA-30c-5p積極調(diào)節(jié)Wnt7b/β-連環(huán)蛋白激活以促進EndMT[45]。長鏈非編碼RNA ZFAS1通過抑制miR-150-5p觸發(fā)EndMT，從而增加EndMT調(diào)控因子Notch3的表達[46]。Yoshimatsu等[47]證實TNF-α可加強TGF-β信號從而增強TGF-β誘導的EndMT。轉(zhuǎn)錄因子活化T細胞核因子1、GATA結合蛋白4、轉(zhuǎn)錄因子SOX9和多功能蛋白聚糖也參與了EndMT。

3 EndMT參與動脈粥樣硬化斑塊形成并影響斑塊穩(wěn)定性

由于動脈粥樣硬化的病理生理學機制涉及多種細胞類型，包括內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和免疫細胞等。因此人們對這些細胞的分化、功能改變進行了研究。目前，EndMT被認為是導致內(nèi)皮細胞分化為促動脈粥樣硬化細胞的一個關鍵過程[48]。

3.1 EndMT是動脈粥樣硬化斑塊中間質(zhì)細胞的來源之一 以間質(zhì)細胞作為來源的平滑肌樣細胞數(shù)量增加是動脈粥樣硬化病理生理過程中的特征。傳統(tǒng)認識中，心肌固有的平滑肌細胞被認為是動脈粥樣硬化平滑肌細胞增殖的唯一來源，但Evrard等[3]利用Scl啟動子成功開發(fā)出內(nèi)皮特異性功能性環(huán)化重組酶，通過內(nèi)皮譜系跟蹤系統(tǒng)確定，小鼠內(nèi)膜斑塊中所有成纖維細胞樣細胞中19%來源于內(nèi)皮源性細胞，外膜中7%～16%的成纖維細胞樣細胞來自內(nèi)皮源性細胞。新近，Depuydt等[49]對人類晚期動脈粥樣硬化斑塊進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，識別出斑塊內(nèi)存在同時具有平滑肌和內(nèi)皮細胞特征的EndMT細胞簇。這證實EndMT可能在動脈粥樣硬化的進展中發(fā)揮積極作用，是動脈粥樣硬化斑塊中間質(zhì)細胞的來源之一。

3.2 EndMT調(diào)節(jié)巨噬細胞表型及功能 巨噬細胞隨組織微環(huán)境變化具有高度可塑性，這使巨噬細胞能夠獲得不同表型，并在復雜的生理過程中發(fā)揮作用。巨噬細胞可在體外動脈粥樣硬化血管壁上積累，影響內(nèi)皮細胞向EndMT表型轉(zhuǎn)變，而EndMT細胞可調(diào)節(jié)巨噬細胞表型和脂質(zhì)攝取。體外實驗發(fā)現(xiàn)，EndMT可同時影響動脈粥樣硬化斑塊表面結構和斑塊內(nèi)部，改變巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的表型。在功能上，EndMT減弱了巨噬細胞的增殖，抗原呈遞細胞標志物的表達，以及氧化低密度脂蛋白反應中TNF-α的產(chǎn)生，并且增加氧化低密度脂蛋白的攝取[50]。EndMT可促進巨噬細胞向吞噬細胞表型轉(zhuǎn)變并減弱巨噬細胞增殖。報道認為，吞噬細胞增多可能有利于減少壞死核心和動脈粥樣硬化病灶的大小[51-52]。巨噬細胞增殖減少，活化低密度脂蛋白引起的TNF-α生成減少，EndMT細胞分泌因子引起的抗原呈遞細胞標志物減少，都可能共同促進炎癥減少，從而使斑塊表型更加穩(wěn)定[53]，這也意味著EndMT對巨噬細胞的影響具有潛在的抗炎作用。

3.3 EndMT與斑塊穩(wěn)定性Evrard等[3]分別檢測穩(wěn)定纖維粥樣斑塊和不穩(wěn)定粥樣斑塊EndMT細胞比例，證實在不穩(wěn)定斑塊中EndMT細胞比例較高，此外斑塊纖維帽的形成與EndMT細胞比例之間也呈反比關系。由此可見，EndMT與動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊和斑塊破裂的出現(xiàn)有直接聯(lián)系。但另一方面，EndMT也可能有助于斑塊的穩(wěn)定性。EndMT誘導內(nèi)皮細胞分化為肌纖維母細胞樣細胞，而肌纖維母細胞樣細胞聚集在與穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊相關的厚纖維帽中[54]。此外，由于EndMT對巨噬細胞具有潛在抗炎作用，因此，可以推測EndMT對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定可能起到動態(tài)調(diào)節(jié)作用。

3.4 藥物抑制EndMT延緩動脈粥樣硬化EndMT是治療心血管疾病的有效靶點。已有研究證實，部分藥物可能通過抑制EndMT，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展。淫羊藿苷通過H19/miR-148b-3p/ELF5軸抑制氧化低密度脂蛋白誘導的EndMT，抑制動脈粥樣硬化[55]。組蛋白去乙酰化酶3在動脈粥樣硬化病變中表達增加，RGFP966是組蛋白去乙酰化酶3的選擇性抑制劑，可抑制主動脈根部EndMT，減少動脈粥樣硬化病變[56-57]。此外，臨床降脂藥物辛伐他汀被證明可通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞中Krtippel樣因子4/miR-483軸抑制EndMT。辛伐他汀也可通過抑制氧化應激和TGF-β/Smad信號通路，減弱EndMT，起到治療動脈粥樣硬化的積極作用[58]。以上研究均證實抑制EndMT在動脈粥樣硬化治療中的潛力。然而遺憾的是，目前仍缺乏有效逆轉(zhuǎn)EndMT的藥物以用于動脈粥樣硬化治療。

4 結語與展望

隨著對EndMT研究的深入，學者們逐漸意識到對EndMT的程度評估和功能定義仍缺乏共識，目前主要通過監(jiān)測各種內(nèi)皮和間質(zhì)標志物表達水平來評估EndMT的進展。但由于已知的內(nèi)皮、間質(zhì)標志物表達具有時間依賴性，對主要通過標志物表達水平來評估EndMT的評價體系不利。細胞機械表型技術已證明其在異質(zhì)性腫瘤中識別不同表型細胞的能力，評估轉(zhuǎn)化細胞的機械表型能夠僅根據(jù)細胞變形能力確定細胞更傾向于間質(zhì)細胞還是上皮細胞。由此推測，這種技術方法可通過動態(tài)監(jiān)測細胞機械表型，克服傳統(tǒng)使用細胞表面標志物評估EndMT的局限，為建立更加精確的EndMT評估體系提供新思路。EndMT是一種復雜、多層面的現(xiàn)象，眾多激活因子和信號通路參與其中，研究也證實，EndMT還有一個反向?qū)霓D(zhuǎn)變稱為“間質(zhì)-內(nèi)皮轉(zhuǎn)化”,有助于心臟損傷后血管新生，這為未來心血管疾病治療提供了積極思路。此外，EndMT在發(fā)育和疾病以外的穩(wěn)態(tài)條件中的作用尚缺乏深入研究，探索內(nèi)皮可塑性和如何平衡EndMT的保護和危害作用將變得更有價值。