張 艷， 劉成元， 吳旭東， 陳 進

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院， 江蘇 鹽城 224000)

肝細胞性肝癌(HCC)在全世界范圍內被列為新發(fā)癌癥病例的第五大原因，也是導致男性癌癥死亡的第二大原因 ，慢性肝病如病毒性肝炎、酒精及非酒精性脂肪性肝病是其主要病因。外科手術、介入、靶向及免疫治療是目前HCC治療的主要手段，但HCC治療后復發(fā)與轉移率仍高，患者總體預后仍差。因此，更好地了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，挖掘潛在的治療靶點，對于HCC的診治具有重要意義。雙特異性磷酸酶(DUSPs)屬于一個家族，成員包括DUSP1-28，其編碼的蛋白質主要負責通過選擇性去磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)參與多種生物學功能的信號轉導包括蛋白泛素化、蛋白酶體降解、氧化、磷酸化、甲基化等[1]。研究表明DUSPs與腫瘤的進展有關：如DUSP1、6高表達于乳腺癌組織，并與乳腺癌患者的術后復發(fā)與轉移風險增加有關；在功能上，差異化表達的DUSPs可能通過誘導上皮間質轉化、調節(jié)乳腺癌細胞干性促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2]。但DUSPs在HCC中是否存在差異性表達及其臨床意義仍未得到研究。本研究通過HCC公共數據與本院臨床病理數據分析，明確在mRNA和蛋白水平上癌與癌旁組織差異性表達的DUSPs，分析其與臨床病理特征、預后、免疫細胞浸潤的相關性，并進一步探討差異性表達的DUSPs在HCC發(fā)生發(fā)展中的生物學功能。以期為HCC的診斷與治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1公共數據來源與分析:本研究中，HCC癌與癌旁組織中差異化表達的DUSPs首先通過Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/)進行初步篩選，具有統(tǒng)計學差異的DUSPs進一步通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫進行驗證[3]。統(tǒng)計學方法采用T檢驗，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。通過GEPIA初步明確差異化表達的DUSPs與HCC患者總生存率(OS)的關系，再進一步通過Kaplan-Meier plotter (http://kmplot.com/analysis/) 數據庫進行驗證與亞組分析[4,5]。統(tǒng)計學方法采用Log rank檢驗，P< 0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數據庫下載HCC患者臨床特征與轉錄組數據，通過二分類回歸檢驗差異化表達的DUSPs與HCC患者年齡、性別、病理分級、腫瘤分期的關系[6]；并通過COX比例風險模型分析DUSPs與HCC患者OS的獨立相關性，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義?；蚋患治?GSEA)軟件(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)用于預測DUSPs在HCC發(fā)生發(fā)展中的生物學功能。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數據庫用于進一步分析差異化表達的DUSPs與肝癌組織中不同免疫細胞浸潤程度及免疫檢查點相關分子表達的相關性，相關性系數r表示相關性大小，P<0.05代表結果具有統(tǒng)計學差異[7]。

1.2臨床資料:收集本院2016年1月至2018年12月經手術切除HCC的癌與癌旁配對組織，記錄HCC患者的性別、年齡、AFP定量值、腫瘤分級、分期。腫瘤的病理分級采用Edmondson分級法，根據腫瘤細胞的分化程度分為I～IV。腫瘤的TMN分期采用第八版AJCC分期標準，根據腫瘤大小、侵犯程度分為I～IV期。

1.3免疫組化分析:配對的癌與癌旁組織中的DUSP12表達采用免疫組化(IHC)的方法進行染色。DUSP12一抗購自Sigma-Aldrich，貨號為HPA008840，二抗購自中杉金橋，貨名為免疫組化通用型試劑盒，貨號為PV-6000；一抗稀釋比例1∶50，免疫組化步驟按照商品試劑盒說明書進行。染色完成后，每張切片在顯微鏡下5個高倍視野下(200x)進行DUSP12陽性細胞的觀察計數。

1.4統(tǒng)計分析:GraphPad7.0用來處理本院收集病歷的臨床、病理及DUSP12基因蛋白表達的數據，兩組間DUSP12基因蛋白表達差異采用T檢驗進行分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1DUSP基因家族在HCC患者癌與癌旁組織中的mRNA表達差異:Oncomine檢索DUSP基因家族在不同癌癥中癌與癌旁組織中的表達差異如圖1所示：在HCC中，DUSP1、DUSP2、DUSP5、DUSP6、DUSP10、DUSP12 mRNA在癌與癌旁組織中表達存在差異；進一步通過GEPIA對上述差異表達的DUSPs進行驗證，結果如圖2所示，與正常組織相比，DUSP1、5、6 mRNA仍在HCC的腫瘤組織中低表達 (P<0.05)，而DUSP12則仍高表達于HCC腫瘤組織(P<0.05)。

圖1 基于Oncomine數據庫的DUSP基因家族在泛癌癌與癌旁組織中的mRNA表達差異。

圖2 基于GEPIA數據庫的HCC差異DUSP基因家族mRNA表達驗證

2.2DUSP基因家族的mRNA差異化表達與HCC患者預后及臨床特征的關系:GEPIA批量分析了DUSP基因家族與HCC患者OS的關系，結果顯示DUSP10、DUSP11、DUSP12、DUSP13、DUSP14、DUSP23的mRNA表達與患者OS生存率有關(圖3A)。結合mRNA差異化表達結果，我們發(fā)現在DUSP基因家族中，DUSP12不僅在HCC的癌組織中高表達，同時高表達該基因的患者OS下降(HR：2，Log rank P：0.00017)。Kaplan-Meier plotter繪制的OS生存曲線也驗證出高表達DUSP12的HCC患者OS下降(HR：1.82，logrank P：0.00091)，亞組分析結果顯示高表達DUSP12對HCC患者OS的影響獨立于種族(白種人或亞洲人)、腫瘤分期(Ⅰ+Ⅱ期或Ⅲ+Ⅳ期)、飲酒(不飲酒或飲酒)、病毒性肝炎(無病毒性肝炎或病毒性肝炎)(圖3B-G)。進一步，我們從TCGA數據庫中下載HCC患者臨床與轉錄組數據，采用多因素COX風險比例回歸模型分析DUSP12 mRNA表達對患者OS的影響，結果如表1所示，多元COX分析結果提示DUSP12 mRNA基因表達水平與患者OS下降獨立相關(HR：1.123，95%CI：1.049～1.203)。在臨床特征的比較中，表2顯示DUSP12 mRNA表達水平與腫瘤的病理分級正相關(OR：2.904，95%CI：1.871～4.554)。

表1 基于TCGA數據庫的DUSP12與HCC患者OS的uniCox與mutiCox分析

表2 基于TCGA數據庫的DUSP12與HCC患者臨床病理特征的相關性分析

圖3 DUSP基因家族的mRNA表達與HCC患者OS的關系

2.3DUSP12在HCC發(fā)生發(fā)展中的功能富集分析:從TCGA數據庫中獲取的轉錄組數據進一步通過GSEA軟件進行針對DUSP12的基因功能富集分析(KEGG)，結果如下圖4所示，共篩選得到5條顯著上調的通路：包括嘌呤代謝、SNARE相關囊泡運動、剪接體、細胞周期、卵母細胞減數分裂，及5條顯著下調的通路：包括初級膽汁酸合成、視黃醇代謝、CYP450代謝、補體與凝血級聯反應、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解。

圖4 DUSP12在HCC發(fā)生發(fā)展中的功能富集分析

2.4DUSP12 mRNA與HCC患者的腫瘤組織免疫細胞浸潤程度及免疫檢查點相關分子mRNA表達的相關性:在線工具網站TIMER分析結果如表3所示，通過純度矯正后，DUSP mRNA表達量與腫瘤組織內B細胞(r= 0.422)、CD8+T細胞(r= 0.285)、CD4+T細胞(r= 0.359)、巨噬細胞(r= 0.396)、中性粒細胞(r= 0.337)、樹突狀細胞(r= 0.406)的浸潤程度正相關，并且DUSP mRNA表達量也與免疫檢查點分子：CTLA4、HAVCR2、LAG3、CD274、CD276、TIGIT、C10ORF54的表達升高有關。

表3 基于TIMER的DUSP12與HCC患者腫瘤組織免疫細胞浸潤程度及免疫檢查點相關分子mRNA表達的相關性

2.5DUSP12蛋白在HCC患者中的差異化表達及其與臨床特征的相關性:本院入組19例HCC患者，一般臨床病理資料如表4所示。分析結果如圖5所示，DUSP12蛋白在HCC癌組織中明顯高表達(P<0.001)，并且與病理分級1與2級的患者相比，分級為3與4級的患者癌組織中DUSP12蛋白表達更高；與臨床分期1期的患者相比，分期為2-4期的癌組織DUSP12蛋白表達更高(圖5A-B)。

表4 驗證隊列中HCC患者的一般臨床病理資料

圖5 DUSP12蛋白在HCC癌與癌旁組織的差異化表達

3 討 論

本研究通過結合公共數據挖掘與臨床病理驗證的方法明確了DUSP基因家族中的DUSP12在mRNA與蛋白水平上高表達于HCC癌組織。高表達DUSP12的HCC患者總生存率下降，并且DUSP12 mRNA表達水平與患者的病理學分級呈正相關關系?；蚬δ芨患治鲲@示DUSP12參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程的機制可能涉及嘌呤代謝、囊泡運動、剪接體、細胞周期信號調控通路的上調，及膽汁酸、視黃醇代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解信號調控通路的下調。在腫瘤免疫微環(huán)境中，DUSP12 mRNA表達水平與腫瘤內B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤程度及免疫檢查點相關分子：CTLA4、HAVCR2、LAG3、CD274、CD276、TIGIT、C10ORF54的表達呈正相關關系。

此前有研究通過轉錄組分析慢性粒細胞白血病患者的差異化表達基因，結果顯示DUSP12 mRNA高表達于腫瘤細胞 ，但該基因在HCC中的表達趨勢目前并不清楚[8]。在本項研究中，我們在DUSP基因家族中僅發(fā)現DUSP12 mRNA在HCC癌組織中高表達并與患者總生存率下降有關，這提示DUSP12的基因表達可能在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DUSP基因家族是哺乳動物中調節(jié)MARKs活性最重要的磷酸酶類，通過去磷酸化MARKs激酶激活環(huán)內蘇氨酸和/或酪氨酸殘基的T-X-Y基序以調節(jié)MARKs的功能。通過調節(jié)MARKs的功能，DUSPs廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，包括誘導DNA的甲基化及抑癌基因蛋白的泛素化，促進抑癌基因的失活及原癌基因的激活。DUSP12屬于DUSPs家族的一員，研究顯示DUSP12具有調控細胞周期從G0/G1期向G2/M期的轉化，及抑制肝細胞凋亡的作用[9]。本研究中GSEA預測的DUSP12在HCC進展中的功能也與上述文獻報道結果一致：DUSP12可能通過調控細胞周期相關分子的表達從而參與HCC的進展。

MAPKs包括c-Jun-NH2末端激酶(JNK)、p38 MAPK和細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)。這些酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在體內廣泛參與調節(jié)各種細胞活動，包括增殖、分化、凋亡、存活、炎癥和免疫[10]。已有大量研究顯示DUSPs通過調節(jié)MAPKs的功能參與調控先天性及適應性免疫應答：如DUSP1已被發(fā)現是先天性免疫的主要調節(jié)因子，并參與適應性免疫中T細胞的激活；DUSP2和DUSP5參與炎癥反應的活化，并被發(fā)現其是正常T細胞發(fā)育和功能所必需的調節(jié)因子[11]?；贒USPs對于免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用，我們也進一步推測DUSPs可能在HCC的免疫微環(huán)境形成中發(fā)揮作用。本研究中，我們發(fā)現肝癌組織中高表達的DUSP12與浸潤的B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤程度正相關，并與免疫檢查點相關分子的表達也呈正相關關系。這提示在HCC的發(fā)生發(fā)展中，DUSP12可能通過促進免疫細胞的浸潤及誘導免疫細胞高表達免疫檢查點分子介導腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現：在DUSP基因家族中，DUSP12顯著高表達于HCC患者的癌組織，并與HCC患者的生存率下降、病理分級增加、免疫抑制微環(huán)境的產生有關。通過闡述DUSP12與HCC患者的臨床關系，將為下一步進行DUSP12在HCC進展中的功能實驗提供理論基礎，并為未來HCC的治療提供更多的靶點選擇。