朱文雄， 袁軼峰， 張 熙， 劉 濤， 李 博， 陳其華

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙 4100072.湖南省第二人民醫(yī)院， 湖南 長沙 410007)

前列腺增生癥(Benign prostatic hyperplasia，BPH)是老年男性常見的泌尿道疾病[1]，引起下泌尿道癥狀，如尿頻、尿急、排尿等待、排尿無力、尿后余瀝不盡等，50歲以上男性發(fā)病率接近50%[2]，80歲以上男性發(fā)病率接近80%[3]。BPH病因目前尚未闡釋清楚，新近研究表明其發(fā)生與前列腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡比例失調(diào)關(guān)系密切。目前BPH的治療方案包括侵入性手術(shù)策略、微波熱療和藥理學(xué)治療。隨著α受體阻滯劑、5α還原酶抑制劑等藥物的應(yīng)用，使得BPH的非手術(shù)治療成為可能。新近研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號通路對胚胎發(fā)育、干細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分化、組織極化和細(xì)胞增殖等過程起著非常重要的調(diào)控作用，眾多增生性疾病、腫瘤發(fā)生都與該通路的異常密切相關(guān)。環(huán)巴胺(Cyclopamine)是一種強(qiáng)大的Hedgehog信號通路阻斷劑，近年來其對前列腺癌的治療作用越來越受到大家的關(guān)注[4]，但其對BPH的干預(yù)作用尚不明確。本研究于2020年6月至2021年5月通過構(gòu)建BPH模型大鼠，觀察前列腺細(xì)胞增殖與凋亡情況，探討環(huán)巴胺對BPH的干預(yù)效果。

1 資料與方法

1.1動物:成年雄性SD大鼠，體重為400g～450g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0006。

1.2主要試劑與儀器:環(huán)巴胺，F(xiàn)ERMENTEK公司。丙酸睪酮，華中藥業(yè)股份有限公司。蘇木素-伊紅，北京索萊寶科技有限公司。蛋白酶K，MB5088，大連美侖生物技術(shù)有限公司。枸櫞酸，F(xiàn)K-mL2089，上海樊克生物科技有限公司。TUNEL，ZK-8005，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB/H2O2顯色液，2014，Invitrogen，上海英駿生物技術(shù)有限公司。胎牛血清，F(xiàn)CS500，Excell Bio，上海依科賽生物制品有限公司。MTT溶液，GD-Y1317，上海古朵生物科技公司。二甲基亞砜，D2650，美國sigma公司。蔡司熒光顯微鏡，Axio Observer A1/D1/Z1，德國。自動酶標(biāo)讀數(shù)儀，BS-1101，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3BPH大鼠模型的構(gòu)建[5]:先按劑量40mg/kg采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉的方式進(jìn)行麻醉，對大鼠皮膚進(jìn)行消毒，在無菌環(huán)境下經(jīng)陰囊摘除雙側(cè)睪丸。術(shù)后大鼠恢復(fù)7d，于第8天選取已去勢且狀態(tài)恢復(fù)較好的模型大鼠，每天按劑量4mg/kg皮下注射丙酸睪酮(將丙酸睪酮溶于植物油中)，持續(xù)30d。

1.4分組、給藥與標(biāo)本獲取:將造模成功的30只BPH大鼠隨機(jī)分為模型組(BPH組)和環(huán)巴胺組(Cyclopamine組)，未造模的15只大鼠為正常對照組(Normal組)。Cyclopamine組大鼠按劑量50mL/Kg腹腔注射10μmoL/L環(huán)巴胺，1次/d，連續(xù)7d；Normal組和BPH組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7d。給藥結(jié)束后，CO2處死大鼠，獲得各組大鼠前列腺組織，對每組大鼠進(jìn)行以下指標(biāo)的測定。用分析天平測前列腺組織濕重，用容積法測各組大鼠前列腺體積，測前列腺指數(shù)(PI)，PI=前列腺濕重/體重。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過相關(guān)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.5前列腺組織HE染色:取右側(cè)頭葉和腹葉前列腺，10%福爾馬林固定24h，常規(guī)沖水，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚5μm，45℃攤片，撈片，60℃烘烤1h后二甲苯脫蠟。水化后常規(guī)蘇木精-伊紅染色，再經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后在蔡司熒光顯微鏡下觀察前列腺組織病理學(xué)變化。

1.6TUNEL法檢測前列腺細(xì)胞的凋亡:將前列腺組織切片放入3% H2O2，室溫孵育10min，蒸餾水洗3次，2min/次；蛋白酶K(20μg/mL)37℃消化30min，PBS洗滌3次，2min/次；室溫下與3% H2O2作用5min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌3次，2min/次；加入含0.1% TritonX-100的0.1%枸櫞酸混合液，置冰上4min，PBS洗滌3次，2min/次；加50μL TUNEL混合液，37℃反應(yīng)1h，PBS洗滌3次，2min/次；DAB/H2O2顯色液室溫作用5min，水洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)采集5個非重疊視野，觀察凋亡小體(apoptotic body)，檢測100個角膜組織中的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。凋亡陽性率以單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分比表示。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7前列腺細(xì)胞的提取、培養(yǎng):取大鼠的前列腺組織，前列腺每葉各取部分，D-Hanks液清洗2次后剪碎，去除肉眼可見的大血管組織，用2%胰蛋白酶室溫消化前列腺各葉30min，離心后用0.06% Ⅱ型膠原酶室溫消化15min，過濾，取濾液加上皮細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，接種于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每48～72h換液1次。培養(yǎng)液為上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10%胎牛血清，添加體積比為1∶100的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物、0.5μg/L β-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子ECGF，100×103U/L青霉素和鏈霉素雙抗。取前列腺移行帶組織按上述方法處理，提取培養(yǎng)前列腺間質(zhì)細(xì)胞。

1.8MTT法檢測前列腺細(xì)胞增殖:取對數(shù)生長期的前列腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備成2.5×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組各設(shè)8孔，每孔100μL，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d時取出培養(yǎng)板，每孔加入5g/L MTT溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將每孔中的上清液吸出，在無光的環(huán)境下每孔加100μL二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻10min，使其充分溶解由活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚晶體，加入自動酶標(biāo)讀數(shù)儀490nm處測定各孔吸光度(OD)值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞活力曲線圖。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較為t檢驗(yàn)，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析。兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠前列腺組織濕重、體積、前列腺指數(shù):三組大鼠前列腺組織濕重、體積、前列腺指數(shù)如表1所示。與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組濕重、體積及前列腺指數(shù)顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。Cyclopamine組與BPH組相比，Cyclopamine組濕重、體積及前列腺指數(shù)顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠前列腺組織濕重體積前列腺指數(shù)

2.2前列腺組織病理學(xué)檢查結(jié)果:前列腺組織HE染色結(jié)果如圖1顯示：Normal組樣本光鏡下可見腺上皮細(xì)胞排列整齊，多呈單層柱狀或立方型，分泌物少，表面光滑，腺上皮細(xì)胞核圓形，位于基底部，核仁明顯，腺體大小一致、排列清晰，腺腔無擴(kuò)張；BPH組樣本光鏡下可見腺上皮呈乳頭狀增生同時向腺腔內(nèi)突出，呈現(xiàn)為鋸齒狀，腺上皮細(xì)胞呈高柱狀、復(fù)層，間質(zhì)和血管擴(kuò)張，伴隨出現(xiàn)充血、水腫，腺體數(shù)量多，排列密集，部分腺體擴(kuò)張，腺腔變大；Cyclopamine組樣本光鏡下腺上皮細(xì)胞多為單層柱狀，間質(zhì)和血管擴(kuò)張充血、水腫較輕，小部分腺腔變大，腺體少數(shù)增生，排列整齊，少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)。

圖1 前列腺組織病理學(xué)觀察(HE染色×400)

2.3TUNEL法檢測前列腺細(xì)胞凋亡結(jié)果:TUNEL染色在光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果如表2、圖2所示：與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組凋亡小體表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BPH組相比，Cyclopamine組凋亡小體表達(dá)率明顯上升(P<0.05)，說明環(huán)巴胺能上調(diào)前列腺增生中凋亡小體的表達(dá)。

圖2 TUNEL法染色結(jié)果及凋亡小體表達(dá)率注：A：TUNEL染色(×400)；B：凋亡小體表達(dá)率結(jié)果。與Normal組比較，*P<0.05；與BPH組比較，#P<0.05。

表2 各組大鼠前列腺細(xì)胞凋亡情況

2.4MTT法測前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增殖能力結(jié)果:MTT法測前列腺間質(zhì)和上皮細(xì)胞的結(jié)果如表3及圖3A-B所示，前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖能力的變化(圖3A)；上皮細(xì)胞增殖能力的變化(圖3B)。與Normal組相比，BPH組和Cyclopamine組細(xì)胞增殖速率明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BPH組相比，Cyclopamine組細(xì)胞增殖速率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明環(huán)巴胺能夠抑制前列腺間質(zhì)和上皮細(xì)胞的增殖，降低其細(xì)胞增殖速率。細(xì)胞計數(shù)法記錄前列腺中間質(zhì)和上皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量的變化(表4及圖3C-D)。三組細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的變化與MTT法測細(xì)胞增殖的變化趨勢基本一致。

表3 各組大鼠前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增殖情況

表4 各組大鼠前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增殖情況

圖3 MTT法測細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞計數(shù)法測細(xì)胞數(shù)量

3 討 論

BPH被認(rèn)為是老年男性最常見的疾病之一，其病理特點(diǎn)為平滑肌以及前列腺過渡區(qū)內(nèi)的上皮細(xì)胞增殖。是一種簡單的微小結(jié)節(jié)性增生，并逐漸發(fā)展成為肉眼可見的結(jié)節(jié)性腫大，并且還可引起尿路癥狀[6]。由于BPH的發(fā)病機(jī)制不甚明了。目前BPH的治療包括經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)，藥物治療和植物療法等[7]。在BPH的研究探索過程中，一些學(xué)者提到BPH是上皮和前列腺間質(zhì)之間由胚胎誘導(dǎo)的相互作用重新喚醒的結(jié)果，上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在BPH的發(fā)病中具有重要意義[8]。

刺猬蛋白(Hedgehog)是指在胚胎發(fā)育期間首次在果蠅中檢測到的一組蛋白質(zhì)[9]。Hedgehog信號通路被證實(shí)是在胚胎組織構(gòu)建過程中組織細(xì)胞增殖和分化的重要參與者，能夠?qū)е履[瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，該信號通路一旦被激活就可以對包括前列腺癌、胰腺癌和胃癌在內(nèi)的疾病的發(fā)生以及發(fā)展產(chǎn)生積極影響。有研究報道了前列腺癌中Hedgehog信號通路的激活[10]。此前，大量研究建立了環(huán)巴胺和Hedgehog信號通路之間的密切聯(lián)系[11]。作為Hedgehog信號通路的抑制劑，環(huán)巴胺在抑制前列腺癌和提高生存率方面起著至關(guān)重要的作用[12]，其能特異性地與膜蛋白受體Smo結(jié)合，抑制該蛋白的活性，從而阻斷Hedgehog信號向核轉(zhuǎn)錄因子Gli及下游靶基因傳導(dǎo)。前列腺癌和BPH同屬前列腺細(xì)胞過度增殖性疾病，而Hedgehog信號通路在前列腺細(xì)胞的生長中已經(jīng)被證明是正調(diào)節(jié)劑和增殖刺激物。因此我們認(rèn)為環(huán)巴胺很可能能夠抑制前列腺細(xì)胞的增生。為了了解它在調(diào)節(jié)BPH中的功能和作用，本研究探索了環(huán)巴胺對BPH大鼠前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

研究結(jié)果表明，環(huán)巴胺能夠降低BPH大鼠的前列腺濕重、體積和前列腺指數(shù)，且對前列腺增生組織的病理形態(tài)有改善作用。就BPH的病理特征而言，通?？梢杂^察到過渡區(qū)以及尿道周圍區(qū)域內(nèi)的上皮和纖維肌肉組織的結(jié)節(jié)性過度生長。腺體增生和間質(zhì)增生都可以促進(jìn)前列腺體積和重量的增加。BPH模型大鼠確實(shí)顯示了較高的前列腺體積和濕重，再結(jié)合HE染色結(jié)果，我們考慮環(huán)巴胺可能可以抑制BPH。我們的研究還顯示，環(huán)巴胺能夠抑制BPH大鼠前列腺組織的細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。盡管發(fā)病機(jī)理不明確，但BPH的發(fā)展與間質(zhì)和上皮細(xì)胞凋亡的減少密切相關(guān)。在前列腺細(xì)胞的生長中，Hedgehog信號通路已經(jīng)被證明是正調(diào)節(jié)劑和增殖刺激物。一旦被環(huán)巴胺抑制，Hedgehog信號通路可導(dǎo)致更多細(xì)胞凋亡，引發(fā)間質(zhì)和上皮細(xì)胞總量的下降，從而阻抑BPH的進(jìn)展。因此，我們認(rèn)為環(huán)巴胺能夠減少BPH大鼠前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其通過阻斷Hedgehog信號通路抑制BPH進(jìn)展的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究去闡明。環(huán)巴胺具有較強(qiáng)的抑制BPH細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但費(fèi)用目前較為昂貴、給藥方式比較單一、毒副作用尚不明確，其發(fā)展成為一種治療BPH的新藥還有很長的路要走。