顧 勇， 楊 艷， 李 娜， 王 艷， 張 姣， 杜 婷， 范小平

(1.武警陜西省總隊醫(yī)院消化內(nèi)分泌科， 陜西 西安 7100002.陜西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科， 陜西 西安 710000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy)是糖尿病患者的主要微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因[1]。腎素-血管緊張素抑制劑是臨床上治療糖尿病腎病十分廣泛的藥物，其具有降低血糖和血壓的雙重作用[2,3]。由于糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，所以針對該病的精準(zhǔn)治療藥物仍處于研發(fā)階段。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種長度約17～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過調(diào)控靶基因的蛋白翻譯過程參與人類疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs的失調(diào)可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[5]。有研究報道，miR-93-5p參與高糖誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程[6]，但是miR-93-5p參與糖尿病腎病進(jìn)展的機(jī)制是否與DUSP8有關(guān)尚未清楚。本研究擬以人腎小球足細(xì)胞HPC為研究對象，觀察miR-93-5p、DUSP8對高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞炎性因子分泌、凋亡的影響，揭示二者之間的靶向關(guān)系，為糖尿病腎病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料:人腎小球足細(xì)胞HPC購自美國菌種保藏中心；microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems；腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)檢測試劑盒、白介素6(interleukin6，IL-6)檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；LipofectamineTM3000購自日本TaKaRa公司；熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素-碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自上海碧云天研究所；Genesys 10紫外分光光度計購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):HPC培養(yǎng)條件：RPMI 1640培養(yǎng)基混合10%胎牛血清，37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換液一次。將HPC細(xì)胞隨機(jī)分成NG組(5mM高糖處理)、HG(6h、12h、24 h)組(25mM高糖處理)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-93-5p組(轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、anti-miR-93-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-93-5p mimics)、HG+ si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、HG+ si-DUSP8組(轉(zhuǎn)染si-DUSP8)、HG+miR-93-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics和pcDNA)、HG+miR-93-5p+ pcDNA-DUSP8組(共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics和pcDNA-DUSP8)。其中HG+ si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、HG+ si-DUSP8組(轉(zhuǎn)染si-DUSP8)、HG+miR-93-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics和pcDNA)、HG+miR-93-5p+ pcDNA-DUSP8組(共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics和pcDNA-DUSP8)組需要在確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行25mM高糖處理12 h。需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞使用LipofectamineTM 3000試劑與質(zhì)?；駾NA混合后與細(xì)胞共同培養(yǎng)10 h，然后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，結(jié)束后用qRT-PCR實驗檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率至少達(dá)到35%確定為轉(zhuǎn)染成功。否則，更管條件繼續(xù)轉(zhuǎn)染，直至達(dá)到要求方可用于后續(xù)研究。

1.2.2qRT-PCR實驗:使用一步法Trizol液提取細(xì)胞中總RNA，通過分光光度計評估RNA的質(zhì)量。結(jié)束后，使用microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，作為模板。使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序設(shè)置為94℃預(yù)變性2min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s進(jìn)行42循環(huán)擴(kuò)增,延伸溫度72℃，5min。最后以GAPDH和U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計算miR-93-5p、DUSP8的相對表達(dá)量。引物信息為：miR-93-5p：正向引物:ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTGTTCGTGC，反向引物:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC；DUSP8：正向引物:tgacccaaaacggaataagc，反向引物:agagatgccagccagacagt。GAPDH和U6使用通用引物。每個樣品做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.3ELISA實驗:收集需要檢測的細(xì)胞，離心取上清。按照白介素6(IL-6)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒的操作說明書操作，檢測IL-6、TNF-α的含量。每個樣品做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.4WB實驗:用裂解溶液處理待檢測的細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白，再將蛋白進(jìn)行定量變性處理。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳把蛋白聚集在瓊脂膠上，并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進(jìn)行封閉處理。將兔抗DUSP8單抗 (1∶1000)、兔抗Cleaved caspase-3單抗 (1∶1000)、兔抗Bax單抗(1∶800)、兔抗Bcl-2單抗(1∶500)稀釋，用各個蛋白的稀釋液4℃孵育過夜。再將膜浸入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，37℃孵育2h。最后對蛋白進(jìn)行顯色，分析。每個樣品做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5Annexin V/ FITC雙染細(xì)胞凋亡檢測實驗:收集需要檢測的細(xì)胞，PBS充分清洗，離心，棄上清，再用 500 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，然后在避光條件下先加入5 μL的 Annexin V/ FITC，避光孵育10 min后再加入5 μL的PI，避光反應(yīng)15 min。結(jié)束后在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗:通過在線預(yù)測網(wǎng)站starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測到DUSP8與miR-93-5p之間存在互補(bǔ)結(jié)合靶點。將含有野生型DUSP8-WT(含有野生結(jié)合位點)或DUSP8-MUT(不含野生結(jié)合位點的突變體)的DUSP8片段克隆至pGL3熒光載體，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體。將HPC細(xì)胞接種24孔板，培養(yǎng)24h，然后將miR-NC、miR-93-5p、anti-miR-NC、anti-miR-93-5p與報告質(zhì)粒用LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染至HPC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，使用熒光素酶試劑盒檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞miR-93-5p、DUSP8表達(dá):結(jié)果如圖1和表1所示，與NG組相比，HG 6h組、HG 12h組、HG 24h組HPC細(xì)胞miR-93-5p表達(dá)均顯著降低，DUSP8的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

圖1 高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞中DUSP8蛋白表達(dá)圖

表1 高糖誘導(dǎo)不同時間的HPC細(xì)胞miR-93-5p DUSP8的表達(dá)

2.2高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞的炎癥因子分泌和凋亡:結(jié)果如圖2和表2所示，與NG組相比，HG 6h組、HG 12h組、 HG 24h組IL-6、TNF-α的含量均顯著升高，Cleaved caspase-3、Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著降低，Bax的蛋白表達(dá)均顯著升高，細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。故選用高糖處理12 h的細(xì)胞最合適。

圖2 高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞凋亡圖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 高糖誘導(dǎo)不同時間HPC細(xì)胞炎性因子分泌量和凋亡率

2.3過表達(dá)miR-93-5p調(diào)控高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞炎性因子分泌、凋亡:結(jié)果如表3所示，與NG組相比，HG組細(xì)胞miR-93-5p、Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白、凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與HG+ miR-con組相比，HG+ miR-93-5p組細(xì)胞miR-93-5p、Cleaved caspase-3、Bax蛋白顯著升高，IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白、細(xì)胞凋亡率均顯著降低，如圖3，(P<0.05)。

表3 過表達(dá)miR-93-5p的高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞炎癥因子分泌凋亡率

圖3 過表達(dá)miR-93-5p的高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4miR-93-5p靶向DUSP8:通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測到miR-93-5p與DUSP8 3'UTR存在互補(bǔ)的結(jié)合位點，如圖4A。熒光報告實驗結(jié)果見表4，相較于miR-con組，miR-93-5p組WT-DUSP8細(xì)胞的熒光活性顯著降低(P<0.05)。與miR-con組相比，miR-93-5p組細(xì)胞DUSP8蛋白表達(dá)顯著降低，與anti-miR-con組相比，anti-miR-93-5p組細(xì)胞DUSP8蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，如圖4B、表5。

表5 miR-93-5p調(diào)控DUSP8的表達(dá)

圖4 miR-93-5p靶向調(diào)控DUSP8

表4 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.5沉默DUSP8調(diào)控高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞炎癥因子分泌、凋亡:與NG組相比，HG組細(xì)胞DUSP8蛋白表達(dá)、IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白、凋亡率均顯著升高(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Bax蛋白顯著降低(P<0.05)；與HG+si-con組相比，HG+si-DUSP8組細(xì)胞DUSP8蛋白表達(dá)、IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖5、表6。

圖5 沉默DUSP8的高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞凋亡圖及相關(guān)蛋白圖

表6 沉默DUSP8對高糖誘導(dǎo)HPC炎癥因子分泌凋亡的影響

2.6過表達(dá)DUSP8表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染miR-93-5p表達(dá)對高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞的調(diào)控作用:與HG+miR-con組相比，HG+miR-93-5p組細(xì)胞DUSP8蛋白、IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白、凋亡率均顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Bax蛋白顯著升高(P<0.05)；與HG+miR-93-5p+pcDNA組相比，HG+miR-93-5p+pcDNA-DUSP8組細(xì)胞DUSP8蛋白、IL-6、TNF-α含量、Bcl-2蛋白、細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6、表7。

圖6 高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 過表達(dá)DUSP8逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-93-5p對高糖誘導(dǎo)HPC細(xì)胞炎癥因子分泌凋亡的調(diào)控

3 討 論

miRNA是一類長度為18-25個核苷酸的單鏈RNA，這些RNA不編碼蛋白質(zhì)，但可通過降解靶標(biāo)的mRNA或阻止mRNA翻譯為蛋白質(zhì)，抑制編碼基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，從而參與疾病的病理生理過程，包括糖尿病的發(fā)生[7]。miR-93-5p在高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞中異常降低，其作為lncRNA X失活特異性轉(zhuǎn)錄本(XIST)的下游因子，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A (CDKN1A)的上游調(diào)控因子發(fā)揮抑制糖尿病腎病中腎間質(zhì)纖維化作用[8]。近期，有報道m(xù)iR-93-5p能夠通過靶向HGF增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的胰島素抵抗力，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖尿病的進(jìn)展[9]。然而，miR-93-5p對高糖環(huán)境下足細(xì)胞的生存影響及機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)研究。本研究為了探究miR-93-5p在糖尿病腎病足細(xì)胞中的功能，在體外用高糖誘導(dǎo)人足細(xì)胞HPC，監(jiān)測高糖處理(6、12、24h)時HPC細(xì)胞中miR-93-5p的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p的表達(dá)水平隨著高糖處理時間的延長而降低；炎性因子IL-6、TNF-α的含量隨高糖處理時間的延長而升高，凋亡抑制基因Cleaved caspase-3、Bcl-2的表達(dá)隨高糖處理時間的增長而降低，凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)隨高糖處理時間的延長而增加，與Yang[8]的研究結(jié)果相呼應(yīng)，與Zhou[9]在肝癌中的實驗結(jié)果相悖。這些實驗結(jié)果說明在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中miR-93-5p發(fā)生降低，炎性因子分泌增加，細(xì)胞凋亡率受到抑制，說明高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型的最適處理時間為12h。進(jìn)一步研究，過表達(dá)miR-93-5p后，受損的HPC細(xì)胞miR-93-5p表達(dá)升高，IL-6、TNF-α的含量也降低，細(xì)胞凋亡率也發(fā)生明顯下降，伴隨Cleaved caspase-3、Bcl-2的表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低。這揭示了miR-93-5p在受損足細(xì)胞中的保護(hù)作用，暗示其在糖尿病腎病足細(xì)胞中的潛在治療價值。深入探究發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p還與DUSP8之間存在互補(bǔ)的靶向關(guān)系，并通過熒光報告實驗驗證，于是推測這可能與miR-93-5p保護(hù)足細(xì)胞損傷有關(guān)。

DUSP8是近兩年新發(fā)現(xiàn)的一個參與糖尿病病理生理進(jìn)程的重要基因。DUSP8是第一個全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定的基因，其主要在大腦中表達(dá)，與人類糖尿病的發(fā)展有關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，DUSP8是二型糖尿病(T2D)的風(fēng)險因子，其與男性下丘腦胰島素抵抗相關(guān)，并且在T2D患者的漏斗核中表達(dá)增加；通過DUSP8敲除小鼠、DUSP8拯救DUSP8敲除小鼠的表型研究，揭示了DUSP8在肥胖環(huán)境中對系統(tǒng)性糖耐量和胰島素敏感性的重要調(diào)控作用。最近，Peter等[12]發(fā)現(xiàn)，DUSP8作為糖尿病風(fēng)險等位基因，在控制人類或小鼠攝取甜味高熱量食物和糖類消耗方面具有積極作用。于是，本實驗假設(shè)DUSP8參與高糖環(huán)境下足細(xì)胞的損傷過程。本研究發(fā)現(xiàn)，DUSP8在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中的表達(dá)異常升高，IL-6、TNF-α的含量上升，Cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax的蛋白表達(dá)升高，并且沉默DUSP8能夠明顯的減輕高糖引起的足細(xì)胞的上述變化。此外，過表達(dá)DUSP8還能夠明顯的抑制過表達(dá)miR-93-5p對高糖引起的足細(xì)胞的炎性因子分泌和凋亡抑制作用。

綜上所述，miR-93-5p抑制高糖誘導(dǎo)人足細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，其產(chǎn)生這種功能的機(jī)制與其靶向抑制DUSP8相關(guān)，為糖尿病腎病的靶向治療提供新靶點。