安 康， 馬正良

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院， 江蘇 南京 210008)

脊髓損傷是臨床上常見的神經(jīng)損傷疾病，以運(yùn)動功能受損和肢體感覺障礙為主要臨床表現(xiàn)，常見于暴力打擊、血腫和腫瘤等。脊髓損傷恢復(fù)較慢，若治療不當(dāng)，可引起肢體癱瘓，造成患者嚴(yán)重殘疾[1]。I型大麻素受體(cannabinoid 1 receptor,CB1R)廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，通過調(diào)制神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，參與認(rèn)知、記憶、感覺和行為控制等活動[2]。研究表明，CB1R在腦卒中、痛覺過敏、抑郁和阿爾茲海默癥等神經(jīng)疾病中發(fā)揮重要作用[3]。然而，CB1R在脊髓損傷中的作用鮮有報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建小鼠脊髓損傷模型，探討CB1R受體激動劑HU-210的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為脊髓損傷的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑:36只SPF級雌性C57/B6小鼠，8～12周齡，由南京大學(xué)模式動物研究所提供，許可證號：SYXK(蘇)2019-0056。HU-210購自美國Sigma公司。白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-17和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國eBioscience公司。鈣離子結(jié)合調(diào)節(jié)因子(IBA)-1、ED-1抗體、髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抗體、神經(jīng)生長因子(NGF)抗體和β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Abcam公司。

1.2模型建立與動物分組:待小鼠適應(yīng)性生活1周，隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組：對照組、模型組和藥物組，每組各12只小鼠。根據(jù)改良Allen's法，利用雌性C57/B6小鼠構(gòu)建脊髓損傷模型[4]。具體方法如下：1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，分離棘突附著肌肉，充分暴露T9～T11節(jié)段脊髓，Allen's打擊器從3cm處自由落體，擊打脊髓。若小鼠出現(xiàn)痙攣性擺尾，雙后肢遲緩性癱瘓，脊髓組織腫脹明顯，提示造模成功。對照組僅暴露脊髓，不進(jìn)行擊打。藥物組小鼠在造模前30min灌胃30mg/kg HU-210，此后每天在同一時(shí)間點(diǎn)灌胃30mg/kg HU-210，連續(xù)14d。

1.3行為學(xué)評分:分別于術(shù)后第1天、第7天和第14天，利用BMS評分和改良Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評價(jià)。BMS評分方法如下[5]：將小鼠置于特制的曠場內(nèi)自由活動，觀察小鼠5min內(nèi)后肢踝關(guān)節(jié)活動度和協(xié)調(diào)性、尾巴姿態(tài)及軀體穩(wěn)定性。依據(jù)具體情況進(jìn)行評分，計(jì)為0～9分，評分越低，則說明運(yùn)動功能障礙越重。改良Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)方法如下[6]：將小鼠置于一塊粗糙、平坦的斜板上，斜板由水平面開始緩慢上升，待小鼠不能停留原有位置而開始跌落時(shí)，停止移動斜板，記錄此時(shí)斜板的傾斜度數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取均值。

1.4血清學(xué)檢測:造模第14天后將小鼠固定在特定容器中，暴露鼠尾，尾靜脈穿刺抽取靜脈血0.2mL，置于離心機(jī)中離心，離心后吸取上層血清，按照試劑盒說明書操作，ELISA法檢測各組小鼠血清IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.5取材:采血后處死小鼠，取出損傷處脊髓組織。隨機(jī)選取6只小鼠脊髓組織，直接置于液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于Western blotting檢測。另6只小鼠的脊髓組織，放入10%福爾馬林中固定48h，用于病理學(xué)檢測。

1.6Western blotting檢測:從-80℃冰箱中取出脊髓組織，加入200μL裂解液提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度并進(jìn)行定量處理。按照20μg/孔進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入封閉液封閉1h，分別加入MBP一抗(1∶1000稀釋)、BDNF抗體(1∶1000稀釋)、NGF抗體(1∶1000稀釋)和β-actin抗體(1∶3000稀釋)，4℃孵育過夜。漂洗后加入二抗室溫孵育1h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，以β-actin抗體為內(nèi)參，分析目的蛋白的表達(dá)。

1.7病理學(xué)檢測:將小鼠脊髓進(jìn)行石蠟包埋后切片，脫蠟入水后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入封閉液封閉1h。沖洗切片后分別滴加IBA-1一抗(1∶200)和ED-1一抗(1∶200)，)，4℃孵育過夜。漂洗后加入熒光二抗，室溫孵育2h后DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封閉、固定后拍片。

2 結(jié) 果

2.1BMS評分比較:與對照組比較，模型組小鼠術(shù)后BMS評分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組小鼠術(shù)后BMS評分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠BMS評分比較

2.2Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較:與對照組比較，模型組小鼠術(shù)后斜板傾斜度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組小鼠術(shù)后斜板傾斜度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3Western blotting結(jié)果比較:與對照組相比，模型組小鼠脊髓組織MBP、BNDF和NGF蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物組小鼠脊髓組織MBP、BNDF和NGF蛋白表達(dá)均進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表3。

圖1 各組小鼠脊髓組織的免疫印跡圖片

表3 各組小鼠脊髓組織蛋白的表達(dá)水平比較

2.4血清炎癥因子表達(dá)比較:與對照組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-17和TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組小鼠血清IL-6、IL-17和TNF-α含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠血清炎癥因子表達(dá)比較

2.5免疫熒光結(jié)果比較:與對照組比較，模型組小鼠脊髓組織IBA1/ED1雙陽性細(xì)胞顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組小鼠脊髓組織IBA1/ED1雙陽性細(xì)胞顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5和圖2。

圖2 各組小鼠脊髓組織免疫熒光染色結(jié)果(放大倍數(shù)200×)

表5 各組小鼠脊髓組織IBA1/ED1雙陽性細(xì)胞比較

3 討 論

大麻素受體由2種經(jīng)典受體CB1R和CB2R組成。其中，CB1R主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括大腦皮質(zhì)、脊髓、海馬和小腦等部位；而CB2R主要分布于造血系統(tǒng)和免疫細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)中亦有少量表達(dá)。生理狀態(tài)下，CB1R通過調(diào)制神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，參與認(rèn)知、記憶、感覺和行為控制等活動。而在病理?xiàng)l件下，CB1R通過抗炎和抗興奮毒性效應(yīng)，在腦卒中、痛覺過敏、抑郁和阿爾茲海默癥等神經(jīng)疾病中發(fā)揮重要作用[3,4]。研究證實(shí)，激活CB1R可降低腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損，改善腦缺血引起的腦損傷。Hughes等研究表明，激活CB1R可減少β淀粉樣蛋白沉積，增加海馬數(shù)量，改善阿爾茲海默癥引起的認(rèn)知功能障礙[3]。

本研究通過腹腔注射特異性CB1R拮抗劑HU-201，探究CB1R在脊髓損傷中的作用。BMS評分和改良Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予HU-201可顯著改善脊髓損傷小鼠的感覺和肢體運(yùn)動功能。MBP約占髓鞘蛋白總量的30%以上，是髓鞘的主要構(gòu)成蛋白[7]。NGF可以營養(yǎng)和促進(jìn)受損傷神經(jīng)元的生長，在維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定方面具有重要作用[8]。BNDF具有促進(jìn)神經(jīng)元再生和分化的作用，使受損的神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，藥物組小鼠脊髓組織MBP、NGF和BNDF蛋白表達(dá)均明顯升高，提示CB1R可以促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)，降低脊髓損傷。

研究表明，免疫炎癥反應(yīng)在脊髓損傷過程中具有重要的作用[10]。其中，炎性細(xì)胞的聚集、浸潤及其釋放的炎性介質(zhì)是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、壞死和凋亡的重要病理過程[10,11]。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)控脊髓損傷后的炎癥過程。生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，通過分泌多種細(xì)胞因子，對神經(jīng)元的正常電活動起到支持、營養(yǎng)和修復(fù)作用。當(dāng)遭受缺血、缺氧、感染和化學(xué)物質(zhì)等病理刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)分鐘內(nèi)就可以被激活，并迅速遷移至受損部位[11,12]。研究表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌IL-6和TNF-α等促炎因子，通過上調(diào)炎癥反應(yīng)，加重脊髓損傷。此外，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,可減輕炎癥反應(yīng),發(fā)揮脊髓保護(hù)作用[12]。

既往研究表明，CB1R在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性和功能方面發(fā)揮重要作用[13]。因此，本研究從調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化角度,探討CB1R對脊髓損傷的影響。IBA-1是在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的鈣結(jié)合蛋白，ED-1是活化小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[13]。因此，本研究利用IBA-1和ED-1雙染標(biāo)記活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明，與模型組比較，藥物組小鼠脊髓組織IBA1/ED1雙陽性細(xì)胞顯著降低。此外，藥物組小鼠血清IL-6、IL-17和TNF-α含量明顯低于模型組，提示CB1R通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮脊髓保護(hù)作用。

綜上所述，CB1R通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)，降低脊髓損傷。因此，CB1R可能是臨床緩解或治療脊髓損傷的潛在靶點(diǎn)。