胡珊珊， 王少文， 蔣 磊

(安徽省第二人民醫(yī)院， 安徽 合肥 230000)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、預后差以及病死率高等特點。最新研究顯示,我國肝癌患者的發(fā)病人數每年超過30萬，嚴重的危害患者生命健康[1]。既往研究證實,手術切除仍然是治療早期肝癌的最佳方式，但是由于肝癌患者早期臨床癥狀表現不明顯，導致多數患者發(fā)現時已經為中晚期，85%以上的患者無法進行手術切除治療[2]。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物對于肝癌治療一直是研究的熱點。人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3，G-Rg3)是人參皂苷中有效的抗腫瘤活性成分之一，能夠抑制肺癌、胃癌、肝癌等細胞增殖，對患者具有良好的治療作用[3,4]。但是目前有關G-Rg3對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制尚不完全清楚。Dickkopf相關蛋白3(Dickkopf-related protein3，DKK3)是屬于Dickkopf家族成員之一，研究發(fā)現，在肝癌患者癌組織中DKK3表達降低，過表達DKK3能夠促進肝癌細胞HepG2凋亡[5]。以上研究表明，DKK3在肝癌患者疾病進展中發(fā)揮重要作用，但是有關DKK3在肝癌細胞增殖和凋亡中的調控機制以及藥物干預研究較少。因此，本實驗擬通過體外培養(yǎng)人肝癌細胞系HepG2，觀察G-Rg3能否通過調控DDK3表達，從而抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，以期為G-Rg3臨床治療肝癌提供新的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑:人肝癌細胞系HepG2(中國科學院上海細胞生物研究所)；人參皂苷Rg3(上海鈺博生物科技有限公司，批號：14197-60-5)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(美國Sigma公司，批號：4030ES20)；噻唑蘭(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT)檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司，批號：C0009S)；細胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、牛血清白蛋白(Bovine albumin，BSA)粉末、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影液檢測試劑盒、羊抗兔IgG抗體(批號：A0239)、羊抗鼠IgG抗體(批號：A0192)、DKK3抗體(批號：ab36898)、Wnt抗體(批號：ab8805)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(批號：ab38449)、β-actin抗體(批號：AF5001)購自上海碧云天生物技術公司。

1.2儀器:TWK-FST32型細胞勻漿儀(武漢泰普拓公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自動多功能酶標檢測儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；1658033型電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3肝癌細胞培養(yǎng)與分組:HepG2細胞采用10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的杜爾貝科的改良鷹培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，貼壁生長，待生長融合度達80～90%時，傾去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS)潤洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3 min至細胞呈現卵圓形，10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基終止消化，進行傳代處理。實驗分為：對照組(Control)、人參皂苷Rg3組(G-Rg3)、人參皂苷Rg3+Dickkopf相關蛋白3無關片段組(G-Rg3+DKK3-NC)以及人參皂苷Rg3+Dickkopf相關蛋白siRNA組(G-Rg3+DKK3-siRNA)。其中G-Rg3組細胞給予G-Rg3(40mg/L)干預48h；G-Rg3+DKK3-NC組細胞轉染DKK3-NC 24h后，G-Rg3干預48h；G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞轉染DKK3-siRNA后，G-Rg3干預48h；Control組細胞正常培養(yǎng)。

1.4MTT法測定肝癌細胞活力:將消化后的HepG2細胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，按照細胞實驗分組進行相關處理，每組設置6個復孔，重復實驗6次，G-Rg3干預處理48h，每孔加入MTT溶液10μL(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去細胞上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)震蕩10min，酶標儀設定波長為570nm檢測各孔的吸光度值，以光密度(optical density，OD)值反應細胞的增殖活力。

1.5流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡:細胞轉染DKK3-NC或是DKK3-siRNA 24h后，G-Rg3干預處理48h，收集各組細胞，PBS潤洗3遍，離心后傾去細胞液，細胞重懸并將濃度調整為1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，在488 nm處，分別激發(fā)525 nm和620 nm帶孔濾波器，檢測FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)熒光，從而得到4組肝癌細胞的凋亡情況。

1.6蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測DKK3、Wnt和β-catenin表達:收集各組細胞；4℃條件下裂解30 min，期間每隔5 min震蕩1次；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應抗體DKK3(1∶1000)、Wnt抗體(1∶1000)、β-catenin抗體(1∶1000)以及β-actin抗體(1∶2000)，4℃過夜，孵育對應的羊抗兔IgG抗體或者羊抗鼠IgG抗體(1∶5000)1～2h；搖床搖晃并加TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。DKK3、Wnt和β-catenin蛋白表達水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結 果

2.1G-Rg3對肝癌細胞增殖的影響:MTT檢測顯示，與Control組相比，G-Rg3組細胞活力明顯從0.65±0.14下降至0.41±0.12(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞活力明顯從0.41±0.12升高至0.58±0.10(P<0.05)，見圖1。

圖1 G-Rg3對肝癌細胞增殖的影響

2.2G-Rg3對肝癌細胞凋亡的影響:流式細胞術檢測顯示，與Control組相比，G-Rg3組細胞凋亡指數明顯從(5.6±1.3)%升高至(44.3±7.5)%(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞凋亡指數明顯從(44.3±7.5)%降低至(15.2±6.3)%(P<0.01)，見圖2。

圖2 G-Rg3對肝癌細胞凋亡的影響

2.3G-Rg3對肝癌細胞DKK3表達的影響:與Control組相比，G-Rg3組細胞DKK3蛋白相對表達量明顯從1.00±0.10升高至2.35±0.28(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞DKK3蛋白相對表達量明顯從2.35±0.28降低至1.14±0.15(P<0.01)，見圖3。

圖3 G-Rg3對肝癌細胞DKK3表達的影響

2.4G-Rg3對肝癌細胞Wnt、β-catenin表達的影響:與Control組相比，G-Rg3組細胞Wnt、β-catenin蛋白相對表達量明顯從1.00±0.09和1.0±0.14分別降低至0.35±0.06和0.38±0.05(P<0.01)。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞Wnt、β-catenin蛋白相對表達量明顯從0.35±0.06和0.38±0.05分別升高至0.91±0.14和0.75±0.23(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

圖4 G-Rg3對肝癌細胞Wnt、β-catenin表達的影響

3 討 論

G-Rg3是從紅參中提取的四環(huán)三萜皂苷活性單體。既往研究顯示，G-Rg3能夠通過抑制多種腫瘤細胞增殖、遷移，促進腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。但是目前有關G-Rg3對肝癌細胞增殖和凋亡的作用機制尚不完全清楚。因此，本研究擬采用體外培養(yǎng)人肝癌細胞系HepG2，探究G-Rg3對細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。

本研究首先觀察G-Rg3對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。MTT與流式細胞術實驗結果顯示，與Control組相比，G-Rg3組HepG2細胞增殖顯著降低，細胞凋亡指數明顯升高，表明G-Rg3能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，與以往研究結果一致。DDK3表達與多種腫瘤發(fā)展密切相關，DKK3能夠充當抑制劑作用，發(fā)揮抗腫瘤活性[7]。為此，本實驗推測，G-Rg3可能是通過促進DKK3表達，從而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。結果顯示，與Control組相比，G-Rg3組肝癌細胞增殖顯著降低，凋亡顯著升高。本研究結果再一次證實，DKK3表達與G-Rg3抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡相關。以往研究發(fā)現，DKK3表達下調是子宮內膜宮頸癌預后的不良標志[8]，那么DKK3是否是G-Rg3抑制肝癌細胞增殖、促進凋亡的關鍵蛋白呢？本研究通過細胞轉染DKK3 siRNA進一步觀察G-Rg3對肝癌細胞增殖和凋亡的作用。Western blot結果顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞DKK3表達顯著降低，DKK3 NC組無顯著變化，表明轉染DKK3 siRNA成功。MTT檢測顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞增殖顯著升高。流式細胞術檢測顯示，與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞凋亡指數顯著降低。以上研究表明，G-Rg3能夠通過促進DKK3表達，從而抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡。Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞凋亡、增殖以及細胞外基質穩(wěn)定的重要途徑，在調控腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[9]。DKK3作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調節(jié)蛋白，被認為是Wnt信號傳導的抑制因子[10]。在結直腸癌細胞系HCT116中DKK3表達下調，過表達DKK3能夠抑制Wnt/β-catenin活化促進腫瘤細胞凋亡[11]。為此，本實驗通過調控DKK3觀察G-Rg3對Wnt/β-catenin信號相關蛋白表達的影響。結果顯示，與Control組相比，G-Rg3組細胞Wnt、β-catenin表達均顯著降低。與G-Rg3組相比，G-Rg3+DKK3-siRNA組細胞Wnt、β-catenin表達均顯著增加。本研究結果與既往研究結果一致。

綜上所述，G-Rg3能夠抑制肝癌細胞增殖，促進凋亡，其機制與促進DKK3表達，抑制Wnt/β-catenin信號傳導相關。