張永超，梁國玲，秦燕，劉文輝，賈志鋒，劉勇，馬祥

（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海大學，青海 西寧 810000）

老芒麥（Elymus sibiricus）是禾本科（Gramineae）披堿草屬（Elymus）的模式植物，又名西伯利亞披堿草、垂穗大麥草等［1］。老芒麥在我國主要分布于西北、東北、華北等地區(qū)，是青藏高原等地區(qū)最重要的飼草之一，也是高寒草甸草原和草甸群落中的優(yōu)勢種和建群種［2］。

植物經過多年的生長，代謝和分子水平突變的積累，逐漸表現出退化癥狀。衰老是植物發(fā)育的重要階段，常常與退化，凋敝，發(fā)病和死亡相關。程序化的衰老是在時間序列上，受到自身發(fā)育和環(huán)境的影響，由遺傳物質嚴格調控植物體內的激素、信號轉導分子、激酶和轉錄因子的系列轉錄和表達完成［3］，是植物對環(huán)境養(yǎng)分波動的快速響應［4］。老齡化是一個與時間相關的變化過程，它與植物整個生活史中的生長、分化、成熟、衰老和死亡各個階段相互融合和相互作用［5］。研究表明，植物衰老受到葉綠體的降解，氮含量降低，脂類代謝加快和激素等內部因素［6］和高溫、低溫、干旱和疾病等外部因素影響［7］。

光合作用是植物積累有機物的重要途徑，而光合作用主要由葉綠素參與完成［8］。研究表明葉綠素含量和光合效率成正比［9］。小麥（Triticum aestivum）葉綠素含量隨著生育期的推進呈先升后降趨勢，花期最大［9］。水稻（Oryza sativa）葉位從高到低，光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學效率（maximal photochemistry efficiency of PSⅡin the light，Fv/Fm）和實際光化學效率（actual photochemical efficiency of PSⅡin the light，ΦPSⅡ）顯著降低，隨著葉片的衰老，葉綠素含量下降［10］。在單一生長季中植物葉片通常會隨著葉位上升，自下而上進行衰老，但偶爾也會出現逆向衰老現象，旗葉早于倒二葉發(fā)生衰老［11］。葉綠素的動態(tài)變化和植物葉片光合特征可以對牧草或作物生長、高產管理提供一定的指導和指示作用，可以反映植物的生長和衰老過程。

植物衰老研究往往關注于一個生長季，某一器官（葉片）的衰老，以一年生植物為主［12—14］，多年生較少，且多年生植物研究也多集中于一個生長季中［15—18］。多年生植物整個生活史過程，年際間葉綠素含量和葉片光合特征的變化是否和植物衰老相關，罕見報道。不同樹齡油茶（Camellia oleifera）的二年生葉片葉綠素含量要高于一年生［16］。紅三葉（Trifolium pratense）衰老葉片中葉綠素、類胡蘿卜素和可溶性蛋白含量顯著降低［19］。毛竹（Phyllostachys heterocycla）葉片光合效率和葉綠素含量在衰老過程中顯著下降［20］。多年生草本植物南荻（Triarrhena lutarioriparia）葉片的衰老等級與葉綠素含量顯著負相關［21］。3齡馬蘭（Kalimerisintegrifolia）凈光合速率顯著低于1、2齡［18］。

土壤養(yǎng)分匱缺是促進植物衰老的重要影響因素。養(yǎng)分添加，尤其是氮素對延緩葉片衰老、提高葉片光合有效作用時間和效率有明顯效果。一年生作物燕麥（Avena sativa）施氮后，其葉面積、葉綠素含量均顯著提高，過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性顯著增強，葉片衰老減緩［12］。隨施氮量的提高，羊草（Leymus chinensis）葉片從上到下葉綠素含量均呈先增加后減小的變化趨勢，低氮水平下，羊草上部葉片葉綠素含量顯著增加，施氮有效增強羊草葉片過氧化物酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，延緩了羊草衰老［22］。本研究選取青藏高原東北部青海湖湖東地區(qū)1～6齡的青牧1號老芒麥作為試驗材料，擬揭示1～6齡過程中老芒麥的葉綠素和光合變化特征，同時探討?zhàn)B分添加對延緩老芒麥衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于青海省海北州西海鎮(zhèn)青藏高原多年生牧草種質資源圃，100°59′E、36°54′N，海拔3159 m，屬高原大陸性氣候，寒冷期長，年平均氣溫0.9℃，最高氣溫30.5℃，最低氣溫—33.8℃，≥10℃年積溫634.5℃。光照充足，太陽輻射強。干濕季分明，雨熱同季，年平均降水量403.6 mm，無霜期30 d。土壤類型為黑鈣土，土壤養(yǎng)分含量為：有機質38.35 g·kg—1、堿解氮2.58 mg·kg—1、速效磷1.36 mg·kg—1、速效鉀21.69 mg·kg—1，土壤pH為8.21［6］。

1.2 試驗處理

本研究選用青藏高原高寒地區(qū)審定登記的青牧1號老芒麥為研究對象。從2015年開始，每年5月中旬進行老芒麥田間種植，播量2.25 g·m—2，行距30 cm，小區(qū)面積15 m2（3 m×5 m），種植當年施入底肥尿素10 g·m—2，過磷酸鈣50 g·m—2。處理1：2015—2020年青牧1號老芒麥田，種植后不做任何處理。處理2：對2020年6齡老芒麥田進行施肥處理，設置氮肥3個處理（45，60和75 kg·hm—2，N的含量），和磷肥3個處理（60，75和90 kg·hm—2），以不施肥為對照。處理3：以2015年建植的老芒麥田，從2016年開始進行每年連續(xù)施肥處理，設置施肥處理16個（表1）。

表1 青牧1號老芒麥田長期施肥處理Table 1 The longer fertilizer treatments of E.sibiricus（kg·hm-2）

1.3 測定項目與方法

在老芒麥開花期（7月底—8月初），采用KONICA MINOLTA，INC公司的SPAD（soil and plant analyzer development）分析儀，從旗葉開始依次向下測定3片葉子的葉綠素相對含量，每個處理隨機選取10株健康植株測定。老芒麥葉片光合特性選取旗葉進行測量，隨機選取5株健康植株測定，選擇天氣晴朗早上10：30—11：30進行，采用LI-COR公司的LI-6400XT便攜式光合作用測量系統(tǒng)測量。青藏高原地區(qū)1齡老芒麥普遍不進行生殖生長，對1齡老芒麥不進行光合測量。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 20.0進行數據分析，采用Microsoft Office Excel 2016整理作圖。

2 結果與分析

2.1 老芒麥1～6齡不同部位葉片葉綠素相對含量變化情況及旗葉光合特征

隨著老芒麥種植年齡的增加，老芒麥葉片葉綠素相對含量呈現降低的趨勢，在1齡和2齡時葉片葉綠素相對含量較高，從3齡開始葉片葉綠素相對含量開始下降，從1齡到6齡，可以劃分為3個階段：1～2齡，3～4齡和5～6齡，這3個階段間葉綠素相對含量存在顯著差異。在6齡時老芒麥葉片出現了逆向衰老現象（圖1A）。

圖1 青牧1號老芒麥1～6齡田（A），6齡田（B）和連續(xù)施肥6齡田（C）的不同部位葉片葉綠素相對含量Fig.1 The leaf chlorophyll content in different part leaf of plant fr om one year s old to six field（A），six years old field（B）and six years old in continuous fertilizer field（C）of E.sibiricus

從2齡到6齡，隨著老芒麥年齡增加，旗葉凈光合速率持續(xù)降低（15.08～6.92μmol·m—2·s—1），4齡和5齡間差異不顯著，其他年齡之間存在顯著差異（圖2A）。老芒麥旗葉胞間二氧化碳濃度隨著年齡的增加呈增加趨勢，6齡顯著高于2，3齡（圖2B）。氣孔導度從3齡開始顯著降低，2齡老芒麥旗葉氣孔導度（0.1374μmol·m—2·s—1）顯著高于其他高齡老芒麥（圖2C）。2齡老芒麥葉片蒸騰速率（4.25 mmol·m—2·s—1）顯著高于其他高齡老芒麥，3～6齡之間旗葉蒸騰速率差異不顯著（2.54～2.75 mmol·m—2·s—1）（圖2D）。

圖2 老芒麥田2齡到6齡葉片凈光合速率，葉片胞間二氧化碳濃度，葉片氣孔導度和葉片蒸騰速率Fig.2 The leaf net photosynthesis rate，the leaf intercellular CO 2 concentration，the leaf stomatal conductance and the leaf transpiration rate from two to six years old of E.sibiricus

2.2 高齡老芒麥（6齡）不同部位葉片葉綠素相對含量對養(yǎng)分添加的響應及旗葉光合特征

施肥普遍提高6齡田老芒麥葉片葉綠素相對含量，且不同部位葉片葉綠素相對含量（33.30%～48.23%）均顯著高于不施肥處理（27.05%～30.72%）。第1片（旗葉）葉片在N75處理下葉綠素相對含量與N60處理差異不顯著，但顯著高于其他施肥和對照處理；P90和P75處理下，旗葉葉綠素相對含量顯著高于P60和對照。第2葉片葉綠素相對含量在N75處理下與N60處理差異不顯著，但顯著高于其他處理，N60處理下顯著高于磷肥處理和對照。第3葉片葉綠素相對含量在氮肥處理下都顯著高于磷肥處理和對照。在P90和P75處理下，葉片葉綠素相對含量顯著高于P60和對照。葉片逆向衰老現象在高氮處理下得到緩解，對照和低磷P60，低氮N45處理下仍然存在葉片逆向衰老現象（圖1B）。

6齡老芒麥田氮肥和磷肥添加處理下，除了P60處理與對照差異不顯著，其他處理下青牧1號老芒麥葉片凈光合速率均顯著高于對照。N60處理下葉片凈光合速率最高（10.77μmol·m—2·s—1）；當氮肥施入一致時，隨著磷素施入量的增加，高磷P90施入處理下，老芒麥葉片凈光合速率顯著高于中度和低度磷肥處理。P90處理下老芒麥葉片凈光合速率除與N45和N75差異不顯著以外，氮肥處理均顯著高于P60和P75（圖3A）。氣孔導度在中高氮（N60，N75）（0.1581，0.1582μmol·m—2·s—1）和中高磷（P75，P90）（0.1117，0.1602μmol·m—2·s—1）處理下顯著高于對照（0.0573μmol·m—2·s—1）（圖3B）。胞間二氧化碳濃度在中高氮處理（N60，N75）和中高磷（P75，P90）處理下顯著高于對照（圖3C）。N45（3.45 mmol·m—2·s—1）和N60（3.21 mmol·m—2·s—1）處理下葉片蒸騰速率顯著高于對照（圖3D）。

圖3 青牧1號老芒麥6齡田施肥處理對葉片凈光合速率、葉片胞間二氧化碳濃度、葉片氣孔導度和蒸騰速率的影響Fig.3 The leaf net photosynthesis r ate，the leaf stomatal conductance，the leaf inter cellular CO 2 concentration and the leaf transpiration rate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six years old under different fertilizer treatments

2.3 老芒麥長期施肥不同部位葉片葉綠素相對含量對養(yǎng)分添加的響應及旗葉光合特征

在連續(xù)施肥6年處理下，老芒麥旗葉葉片葉綠素相對含量在N0P60，N0P75處理下與對照差異不顯著，其他氮磷交互施肥處理下，旗葉葉綠素相對含量均顯著高于不施肥處理，氮肥的連續(xù)施入可有效提高老芒麥旗葉葉綠素相對含量；N75P0（47.94%），N60P60（47.61%）和N45P90（45.58%）處理下，旗葉葉綠素相對含量較高；在低氮N45處理下，旗葉葉綠素相對含量隨著磷肥量增加，呈逐漸增加的趨勢。在N60這一水平處理，N60P60顯著高于其他處理。N75處理水平下，N75P0處理葉綠素相對含量在N75處理下顯著高于其他磷肥處理（圖1C）。

連續(xù)施肥可有效提高6齡老芒麥凈光合速率（4.07～12.27μmol·m—2·s—1）。其中N60P0（12.27μmol·m—2·s—1）和N60P75（11.97μmol·m—2·s—1）施肥處理顯著提高老芒麥葉片凈光合速率。單獨磷素的添加可以提高老芒麥葉片凈光合速率，尤其是高濃度磷P90顯著高于其他單獨磷肥處理；單獨氮肥處理下，低度和中度氮肥處理（N45，N60）下葉片凈光合速率顯著高于不施氮肥和高濃度氮肥處理；氮磷配合施入處理下，總體表現出中度氮肥N60結合磷肥可較好地提高老芒麥葉片凈光合速率（圖4A）。

圖4 青牧1號老芒麥連續(xù)施肥6齡田中施肥處理對葉片凈光合速率，氣孔導度，胞間二氧化碳濃度和蒸騰速率的影響Fig.4 The leaf net photosynthesis rate，the leaf stomatal conductance，the leaf intercellular CO 2 concentration and the leaf transpiration r ate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six year s old in continuous fertilizer field

長期施肥，6齡老芒麥旗葉氣孔導度為0.0447～0.1425μmol·m—2·s—1。N0P90，N45P0，N60P0，N60P60，N60P75施肥處理老芒麥葉片氣孔導度分別為0.1425，0.1217，0.1407，0.1335，0.1181μmol·m—2·s—1，普遍高于其他處理。氮磷配合施入總體表現出在低氮和中氮條件下，老芒麥葉片氣孔導度隨著磷濃度的增加而降低，N45P0處理顯著高于N45P60，N45P75和N45P90處理。在N60處理下，N60P0，N60P60和N60P75的氣孔導度之間差異不顯著，但均顯著高于N60P90處理。高氮施入處理下，老芒麥葉片氣孔導度隨著磷濃度增加，呈現增加的趨勢，N75P90處理下氣孔導度顯著高于N75P0處理（圖4B）。

6齡老芒麥旗葉葉片胞間二氧化碳濃度為190.57～282.60μmol·mol—1。N0P90，N45P0，N60P60施肥處理老芒麥葉片胞間二氧化碳濃度分別為277.35，258.28，282.60μmol·mol—1，普遍高于其他處理。中氮N60條件下，P75和P90施入下葉片胞間二氧化碳顯著低于N60P0和N60P60。中氮和低磷組合處理下植物葉片胞間二氧化碳濃度最高（圖4C）。

6齡老芒麥旗葉葉片蒸騰速率在長期施肥N60P75，N60P0，N0P90，N75P90處理下分別為4.12，4.09，3.70和3.94 mmol·m—2·s—1，普遍高于其他處理，不施肥處理下（1.35 mmol·m—2·s—1）最低。N45施入時，施入磷肥后普遍降低了葉片蒸騰速率。N60和磷肥配合施用使葉片蒸騰速率普遍高于其他施肥處理。高氮處理條件下，老芒麥葉片蒸騰速率隨著磷肥濃度的增加而增加，N75P90和N75P75均顯著高于對照（圖4D）。

3 討論

植物葉片葉綠素的衰減和含量降低是植物衰老過程中最顯著的表型變化之一［23］。根據基因調控假說，植物葉片衰老是基因在特定環(huán)境條件下順序性表達所引起的一系列生理生化代謝的過程。營養(yǎng)失調假說認為葉片衰老是由于植物個體的生殖器官對營養(yǎng)物質的需求量加大，主要的養(yǎng)分生產器官葉片供應能力不足，代謝功能失調而導致衰老［15］。本研究中也發(fā)現青牧1號老芒麥在3齡后出現了明顯衰老的趨勢，主要表現在葉綠素含量的降低，光合效率的減弱，同化物的合成降低，老芒麥整體出現衰老變化。

3.1 葉綠素及光合特征

在多數作物研究中，植物葉片葉綠素含量隨著葉位自下而上順序性降低；光合速率自下而上逐漸增大，且光合速率下降開始的時間以旗葉最晚；蒸騰速率、氣孔導度始終維持旗葉＞倒二葉的規(guī)律［11］。本研究中，青牧1號老芒麥在生長早中期1～3齡葉綠素含量表現出同樣的規(guī)律，在后期6齡出現了逆向衰老現象。在小麥生長后期，旗葉葉綠素首先降低，光合速率的衰減滯后于葉綠素的變化［11］，也出現逆向衰老現象。1～3齡的全葉馬蘭（Kalimeris integrifolia）研究中，到秋季3齡全葉馬蘭凈光合速率和蒸騰速率顯著低于1和2齡［18］。在一個生長季節(jié)內，多年生豆科紅三葉在衰老過程中，葉綠素明顯下降［19］，多年生植物南荻隨著葉片衰老程度加深，葉綠素含量顯著降低［21］。毛竹雖為多年生常綠植物，但其葉片有著明顯的老幼更替過程，其葉片的光合效率和葉綠素含量在衰老過程中均顯著降低［20］。本研究中老芒麥葉綠素相對含量降低和光合效率的衰減表明1～6齡的老芒麥葉片存在衰老漸進特征。在跨年際的研究中，對6齡，30齡和＞100齡的油茶一年生葉片和二年生葉片進行分析發(fā)現，＞100齡的古樹二年生葉片葉綠素含量最高，古樹中超氧化物歧化酶，過氧化物酶和過氧化氫酶活性強于30齡和6齡［16］。本研究及多數研究中葉綠素含量在衰老過程中降低的結論與此不一致，這可能是木本植物和草本植物生活策略存在差異以及油茶較大的年齡跨度引起的。

3.2 土壤養(yǎng)分添加

氮素是植物生長的必要元素，青藏高原地區(qū)老芒麥一年種植，多年利用，除了種植當年養(yǎng)分添加外，以后幾乎沒有養(yǎng)分添加，多年生老芒麥種子田的退化和土壤養(yǎng)分密切相關。紅樹（Rhizophora apiculata）葉片在衰老中N，P含量降低［24］。植株缺氮時葉片中葉綠素的合成受阻，從而導致葉部分功能降低［22］。

在以往的研究中，適宜施氮量可提高小麥葉片葉綠素含量［25］，羊草葉片葉綠素含量在施氮后，從上到下呈先增加后減小的變化；低濃度施氮處理顯著提高2茬沙地羊草葉片葉綠素含量，同時提高葉片中POD活性和MDA含量顯著降低，推遲羊草衰老［22］。李京濤等［26］利用連續(xù)28年長期定位施肥試驗發(fā)現，有機肥和一定量的氮肥配合施用能顯著抑制小麥根系細胞膜脂過氧化過程，提高了小麥根系SOD活性、降低了MDA含量，從而延緩植株衰老進程。本研究中養(yǎng)分添加老齡化施肥和連續(xù)的定點施肥結果與前期研究一致［22，25—26］，氮磷添加均有效提高6齡老芒麥葉綠素含量和光合速率，連續(xù)施肥處理下低氮即可持續(xù)保持老芒麥較高的葉綠素相對含量，本研究中磷素對保持老芒麥葉片葉綠素相對含量效果不顯著；中度氮肥長期施入，同時配合磷肥添加，可有效維持高齡老芒麥葉片光合效率，可作為老芒麥施肥的參考。多年生牧草種植過程中土壤養(yǎng)分的逐漸流失，可能是導致其衰老的關鍵因素。

3.3 光合和氮素

葉片衰老在植物養(yǎng)分循環(huán)，尤其是氮素的循環(huán)中扮演重要的角色［18］，進入衰老程序的葉片器官內氮素調動引起葉綠素含量降低，光合作用減弱。外源氮素的添加有利于維持衰老后期根系的活力，減少衰老葉片氮素輸出，可以緩解這一過程［27］。本研究中老芒麥在高齡階段出現的逆向衰老現象符合衰老過程中養(yǎng)分轉移這一規(guī)律，同時外援氮素的添加，可以明顯緩解逆向衰老。氮素是葉綠素的主要成分，它能促進葉綠體基粒面積增大，葉綠素含量提高，提高Rubisco酶活性，增加胞間CO2濃度。同時氮素能減少細胞內活性氧等物質的產生，提高活性氧清除酶的活性［28］，緩解光合能力的下降，延長和提高了植物葉片的光能功能期和光合效率，放緩了植物整體的衰老進程［29］。

4 結論

隨著青牧1號老芒麥年齡的增加，葉片葉綠素相對含量顯著降低，可以作為老芒麥田衰老的一個表征指數。本研究初步按照老芒麥葉片葉綠素的相對含量，將老芒麥年際間的生長分為3個階段，＞45%，35%～45%，＜35%，依次為生長早期，中期平穩(wěn)期和后期衰老期。

高齡青牧1號老芒麥，在中、高氮磷添加下可有效提高葉片葉綠素相對含量和光合效率，有效緩解逆向衰老。在老芒麥連續(xù)生長過程中，結合葉綠素相對含量，葉片葉綠素相對含量為35%～45%時，可以進行外援養(yǎng)分尤其是氮素的添加。