和 娟，唐 燕，李曉瑞，李海蘭，周春菊，呂金印

(西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

小麥是我國北方主糧作物，其總產(chǎn)量涉及到國家糧食安全，不同生長期的季節(jié)性干旱是造成中國北方冬小麥減產(chǎn)的主要原因[1]。小麥穗部非葉器官是除旗葉外重要的光合同化物來源[2]。芒作為穗部重要的光合器官，占穗部50%～60%的光合面積，潛在地增加了小麥對光的捕獲[3-4]，對籽粒的光合貢獻約占穗部凈光合的50%[5]。大麥中芒光合可占穗部凈光合作用的90%[6-7]。對小麥近等基因系(NILs)的研究表明，芒的存在增加了籽粒體積。但因籽粒數(shù)量減少，最終產(chǎn)量不一定增加，而籽粒數(shù)量減少可能是芒的生長消耗了碳同化物[8]，從而使可供小花原基發(fā)育的同化物分配量減少[9]。目前，有關芒的光合貢獻仍存在爭議，而更多的研究仍支持芒的存在是促進穗光合的主要因素[1,5,10-11]。

小麥穗部在干旱下可保持較高的滲透調(diào)節(jié)能力[13]，相比旗葉具有較高的相對水分含量[14]。研究表明，芒因其特殊的解剖結構而具有一定的抗旱保水能力[15]。蔗糖是植物中光合碳同化物運輸?shù)闹饕问絒16]，蔗糖合成酶(Sucrose synthase, SS)和蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)是蔗糖合成的關鍵酶[17-18]。蔗糖合成酶催化果糖和核苷二磷酸(NDP)之間糖基部分的轉移是可逆的(蔗糖+NDP?NDP-葡萄糖+果糖)，其轉化平衡與pH值有關，當7.5

干旱處理下，有關小麥芒等非葉器官對籽粒的光合貢獻及其蔗糖淀粉合成酶活性與基因表達的研究較少，本研究于小麥灌漿期進行水分虧缺處理，測定籽粒灌漿過程中小麥旗葉和芒凈光合速率、蒸騰速率、葉綠素含量和相對含水量等生理指標，分析蔗糖和淀粉含量及其合成關鍵酶活性與基因表達水平，以期為研究干旱脅迫下小麥生育后期穗部芒的光合貢獻提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗品種選用‘鄭引1號’小麥，盆栽試驗于2017年10月—2018年6月在西北農(nóng)林科技大學遮雨網(wǎng)室中進行。使用上、下口直徑和高分別為23、16 cm和18 cm的聚乙烯塑料桶；試驗土壤類型為紅油土，取自大田耕作層(0～20 cm)，風干后過篩(每公斤土拌入尿素0.447 g、磷酸二氫鉀0.2 g)，播種前每盆裝土6.5 kg(風干土含水量為14.7%)。每盆點播22粒小麥種子，于小麥三葉期定苗12株，同時剪去分蘗。本試驗設置對照組(CK)和水分虧缺(WD)兩組處理，土壤水分分別保持在田間持水量的70%～75%(CK)和40%～45%(WD)，土壤凈含水量分別為20.51%～21.98%和11.72%～13.19%。本試驗在開花前5 d開始控水，通過稱重法每天按照控水標準補水，使每盆小麥土壤含水量于開花時達到控水標準?；ê?、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00采集小麥旗葉和芒，兩組處理不同器官各采集3個生物學重復，稱重后-80℃冰箱保存，待測其他指標。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合參數(shù)的測定 根據(jù)Jia等的方法[22]，在花后0、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00，選取對照(CK)和水分虧缺(WD)兩組處理小麥植株，采用便攜式光合測定系統(tǒng)(LI-6400XT，LiCor，USA)測定旗葉和芒的凈光合速率(Pn)與蒸騰速率(E)，每個處理設5個生物學重復。芒光合參數(shù)的測定參考Hosseini等[23]和施生錦等[12]的方法,并做了一些修改，將芒迅速剪下整齊無重疊排列于標準葉室中，測定其光合參數(shù)。實際參與光合的芒表面積用Epson Perfection V800 photo根系掃描儀(SeikoEpson Corporation, Nagano Prefecture, Japan)測定。旗葉光合參數(shù)的測定按常規(guī)方法進行。

1.2.2 葉綠素含量(Chl)、相對水分含量(RWC)和丙二醛(MDA)含量的測定 葉綠素含量測定參照《植物生理學實驗指導》的方法[24]。將旗葉和芒剪成0.5 cm長小段浸泡于25 ml 80%丙酮中，于黑暗中提取2 d至樣品變白。過濾后的葉綠素提取液分別在663 nm和646 nm下測定吸光度，以80%丙酮為空白對照。每個處理設3個生物學重復。

RWC的測定參照Maydup等的方法[1]。采集不同處理芒、旗葉，稱鮮重(wi)，浸泡于蒸餾水中，4℃處理過夜，取出稱重(wf)，然后60℃下烘48 h至恒重，稱重(wd)。每個處理設3個生物學重復。

MDA含量的測定參照Li等的方法[11]。將樣品放入提前預冷的研缽中，加入3 ml 0.05 mol·l-1磷酸緩沖液(pH值7.8)研磨成勻漿，轉移至10 ml離心管中，加入3 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液(用5%三氯乙酸溶解)，搖勻。沸水浴10 min后冷卻，3 000 g離心15 min，取上清液測532、600 nm和450 nm處的吸光度，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白。每個處理設3個生物學重復。

1.2.3 蔗糖含量、淀粉含量與可溶性糖含量的測定 提取液的制備參考張志良等[25]的方法，蔗糖含量測定用間苯二酚法[26]，可溶性糖和淀粉含量的測定采用蒽酮-硫酸法[25,27]。

1.2.4 酶活性測定 蔗糖合成酶(SS，合成方向)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性測定參考Wardlaw的方法[28]。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性測定根據(jù)Nakamura等的方法[29]進行。上述酶活性測定每個處理均設3個生物學重復。

1.2.5 蔗糖和淀粉合成關鍵酶基因表達差異的測定 RNA提取、cDNA合成及實時定量RT-PCR參照Li等的方法[30]。用Primer Premier 6.0設計引物，蔗糖和淀粉合成關鍵酶相關基因(SS1,SS2,SPS1,AGPase,SSS)引物及內(nèi)參基因actin的引物見表1。基因表達水平的計算用2-ΔΔCT公式[32]。

表1 小麥芒和旗葉中蔗糖和淀粉代謝關鍵酶基因實時定量RT-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比較(P<0.05)檢驗差異顯著性，采用Graphpad prism 6.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 水分虧缺對芒和旗葉凈光合速率和蒸騰速率的影響

小麥灌漿期旗葉凈光合速率(Pn)呈持續(xù)下降趨勢(圖1A)。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理(WD)旗葉Pn下降速率較快。但芒Pn呈現(xiàn)先增后減趨勢(圖1C)，花后8 d達到峰值。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理花后16、24 d旗葉Pn分別下降了29.5%、87.7%，而芒Pn則分別下降了14.2%、11.4%。旗葉Pn降幅明顯高于芒。旗葉和芒的蒸騰速率(E)表現(xiàn)出與Pn相似的趨勢(圖1B)，花后4 d芒E達到峰值(圖1D)。與正常供水處理(CK)相比，水分虧缺處理花后20 d旗葉E下降了40.1%，而芒E則下降了20.9%。表明水分虧缺狀態(tài)下小麥芒的Pn和E所受抑制小于旗葉，芒在兩種處理下均表現(xiàn)出了一定的光合持久性。

2.2 水分虧缺對芒和旗葉葉綠素含量、相對水分含量和丙二醛含量的影響

在灌漿期小麥旗葉葉綠素(Chl)含量呈持續(xù)下降趨勢(圖2A)，芒Chl含量呈先增后減趨勢，于花后8 d達到峰值(圖2D)。與對照(CK)相比，水分虧缺處理(WD)旗葉Chl含量在花后20、24 d分別下降了58.0%、50.2%，而芒Chl含量在花后20、24 d分別下降了15.9%、9.9%，旗葉Chl含量降幅明顯大于芒。表明水分虧缺狀態(tài)下芒中葉綠素降解較慢，相比旗葉表現(xiàn)出了衰老延遲現(xiàn)象。

旗葉和芒相對水分含量(RWC)表現(xiàn)出與Chl相似的趨勢。與對照(CK)相比，在花后20、24 d水分虧缺處理旗葉相對水分含量(RWC)分別下降了7.6%、13.9%(圖2B)，芒RWC分別下降了2.1%、1.5%(圖2E)。相比旗葉，芒有較好的保水能力，可能是其在水分虧缺下具有更高光合效率的原因之一。

旗葉和芒丙二醛(MDA)含量呈持續(xù)上升趨勢，且旗葉MDA含量顯著上升。與對照相比，水分虧缺處理花后4、12、24 d旗葉MDA含量分別增加了19.3%、19.4%、50.8%(圖2C)，而芒在花后4、12、24 d分別增加了9.8%、14.5%、14.0%(圖2F)。芒中MDA增幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺下芒的MDA積累少，相比旗葉具有較強的抗氧化能力，其膜脂過氧化對細胞的損傷程度相對較小。

2.3 水分虧缺對小麥芒和旗葉中蔗糖、淀粉和可溶性糖含量的影響

隨著小麥灌漿進程旗葉和芒中蔗糖含量呈先升后降趨勢，并在花后8 d達到峰值(圖3A，3D)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉蔗糖含量下降速率較快，花后4、12、24 d旗葉蔗糖含量分別下降了28.0%、33.7%、50.1%，芒蔗糖含量分別下降了13.7%、14.1%、18.2%，明顯低于旗葉的降幅。芒和旗葉淀粉含量在灌漿過程中呈現(xiàn)出與蔗糖含量相似的趨勢(圖3B，3E)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理灌漿中期(花后12 d)旗葉和芒中淀粉含量分別降低了19.5%、7.0%。在灌漿中后期，花后16、24 d水分虧缺下旗葉淀粉含量分別降低了23.3%、46.4%，芒中淀粉含量分別降低了8.1%、18%，降幅明顯小于旗葉。說明水分虧缺下芒中蔗糖和淀粉含量受影響較小，為灌漿中后期籽粒中同化物的重要來源。

由于粗過濾器2016年下半年進行過內(nèi)部檢修，失效可能性較小而且粗過濾器拆檢工程量相對較大，先對細過濾器進行開罐檢查；濾料剩余不到一半，表面的無煙煤基本消失，而且濾料中大量泥土類雜質(zhì)，基本確定細過濾器失效。

與蔗糖和淀粉含量變化類似，在灌漿期小麥旗葉和芒可溶性糖含量呈先上升后下降趨勢，峰值出現(xiàn)在花后4 d(圖3C，3F)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理花后4、12、24 d旗葉可溶性糖含量分別下降了21.2%、14.1%、64.4%，芒中可溶性糖含量分別下降了10.6%、6.9%、16.2%，旗葉可溶性糖降幅明顯高于芒。說明芒的可溶性糖含量受干旱脅迫的影響較小，其滲透調(diào)節(jié)能力更強。

2.4 水分虧缺對小麥芒和旗葉中蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合酶、腺苷二磷酸焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性的影響

小麥灌漿期旗葉和芒蔗糖合成酶(SS，合成方向)活性呈先升后降趨勢(圖4A、4E)，花后8 d達到峰值。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉SS活性下降速率較快，花后8、24 d旗葉SS活性分別下降了15.0%和30.1%，而芒SS活性則分別下降了11.5%和8.3%，旗葉SS活性降幅明顯高于芒。旗葉和芒的蔗糖磷酸合酶(SPS)活性表現(xiàn)出與SS相似的趨勢，花后8 d達到峰值(圖4B、4F)。與正常供水處理相比，花后8、24 d水分虧缺處理旗葉SPS活性分別下降了13.7%和36.0%，芒則分別下降了7.3%和14.8%，降幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺對芒中蔗糖合成關鍵酶活性影響較小。

小麥灌漿期旗葉和芒腺苷二磷酸焦磷酸化酶(AGPase)活性呈先升后降趨勢，花后8 d達到峰值(圖4C、4G)。與正常供水處理相比，水分虧缺處理旗葉和芒花后8 d AGPase活性分別下降了20.8%和8.4%；在灌漿中后期(花后12、24 d)，旗葉AGPase活性分別下降了27.8%和32.3%(圖4C)，芒則分別下降了10.7%和7.9%(圖4G)，旗葉AGPase活性降幅明顯高于芒。旗葉和芒的可溶性淀粉合成酶(SSS)活性表現(xiàn)出與AGPase相似的趨勢，花后8 d達到峰值(圖4D、4H)。與正常供水處理相比，花后8 d水分虧缺處理旗葉和芒SSS活性分別降低了15.9%和10.2%；花后20、24 d旗葉SSS活性分別下降了27.8%和36.2%，芒分別降低了15.0%和7.0%，明顯低于旗葉的降幅。說明在干旱處理下，相對于旗葉，芒中淀粉合成關鍵酶受到的損傷較小，在小麥灌漿中后期仍能保持一定的碳同化能力。

2.5 水分虧缺下小麥芒和旗葉蔗糖與淀粉合成相關基因表達差異

小麥灌漿期旗葉和芒中蔗糖合成酶基因(SS1、SS2)和蔗糖磷酸合酶基因(SPS1)表達水平呈先升后降趨勢，花后4d達到峰值(圖5)。與正常供水處理相比，花后4、12 d水分虧缺處理旗葉SS1表達水平分別下降了23.1%、30.4%，SPS1表達水平分別下降了11.8%、7.7%；而芒中SS1表達水平分別下降了9.5%、6.7%，SPS1表達水平分別降低了20.0%、9.5%，芒中基因表達水平降幅明顯低于旗葉。水分虧缺下SS2表達水平整體呈逐漸下降趨勢，花后4 d有小的增幅。與正常供水處理相比，花后4、12d水分虧缺下旗葉SS2表達水平分別下降了14.8%、25.0%，芒則分別下降了10.4%、12.5%，明顯低于旗葉的降幅。在整個灌漿期旗葉與芒蔗糖合成相關基因表達水平變化趨勢，與蔗糖合成相關酶活性變化趨勢基本吻合，同時與蔗糖含量變化趨勢一致。

與正常供水處理相比，水分虧缺處理花后4、12 d旗葉中AGPase表達水平分別下降了13.3%、16.7%，SSS表達水平分別下降了20.0%、14.3%；而芒中AGPase表達水平分別下降了6.3%、15.4%，SSS表達水平分別降低了6.3%、8.3%，芒中AGPase、SSS表達水平降幅明顯低于旗葉。灌漿前中期(花后4、8、12 d)淀粉合成相關基因表達水平上升，與淀粉含量和淀粉合成關鍵酶活性變化趨勢一致。

3 討 論

旗葉是小麥的主要光合器官，但近年來有研究表明，穗光合對小麥產(chǎn)量貢獻顯著，尤其是在水分虧缺下[32]。當小麥旗葉光合作用在花后逐漸下降時，穗部仍然保持一定光合活性，尤其是在灌漿中后期穗部依然可為生長的籽粒提供光合產(chǎn)物[22]。芒著生于穗部頂端，有更大的光合面積，便于獲取光能，使其在光合作用方面更有優(yōu)勢[33]。本研究表明，在小麥灌漿過程中，旗葉凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(E)在灌漿中后期快速下降，而芒Pn和E降幅明顯小于旗葉。與正常供水處理相比，水分虧缺處理芒的Pn和E降幅明顯小于旗葉。表明水分虧缺下芒在灌漿中后期仍能保持一定的光合能力，在灌漿后期可保持比旗葉更高的光合效率。

相比于旗葉，水分脅迫下穎殼和芒更好的水分狀態(tài)與其更強的滲透調(diào)節(jié)能力和更高的相對水分含量有關[2]。本研究中水分虧缺下旗葉葉綠素(Chl)含量和相對水分含量(RWC)隨著灌漿進程快速下降，而芒Chl含量和RWC在灌漿中后期降幅明顯小于旗葉。相比于旗葉，水分虧缺下芒具有衰老延遲性和更好的保水性。水分虧缺下芒中MDA含量增幅明顯小于旗葉，芒具備更強的抗氧化能力。這些特性均為芒保持一定的光合速率奠定了基礎。

4 結 論

1)灌漿期水分虧缺處理對小麥旗葉光合作用的影響較芒顯著(P<0.05)，隨著灌漿的進行，旗葉和芒Pn、Chl含量和RWC均呈下降趨勢，與CK處理相比，花后24 d旗葉Pn、Chl含量和RWC分別下降了87.7%、54.1%和13.9%，芒中則分別下降了14.4%、12.3%和1.5%。相比旗葉，芒表現(xiàn)出保水性和光合持久性。

2)灌漿期水分虧缺處理對小麥旗葉光合碳同化物合成的影響較芒顯著(P<0.05)。灌漿期間旗葉和芒中蔗糖、淀粉含量及其合成關鍵酶的活性和基因表達水平均下降，特別是在灌漿中后期，旗葉中降幅明顯大于芒，表現(xiàn)出芒持續(xù)合成光合產(chǎn)物的能力。

3)灌漿期間水分虧缺下芒中丙二醛含量增幅顯著小于旗葉，表現(xiàn)出更強的抗氧化能力；可溶性糖含量降幅顯著小于旗葉，有更強的滲透調(diào)節(jié)能力。