王朋磊，剡轉轉，高莉娟，馬倩，宗西方，王升升，張吉宇

（蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020）

隨著人們對飲食水平的提高，畜牧業(yè)對牧草飼料的產量及品質也要求更高［1］，但一些地區(qū)生境條件殘酷不適合抗逆性差的牧草生長，無法產出足夠的牧草，導致“人畜共糧”的現(xiàn)象嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展［1—2］。草木樨為一年生或兩年生豆科草本植物［1］，常見栽培種為白花草木樨（Melilotus albus）和黃花草木樨（Melilotus officinalis），白花草木樨的適應性廣泛，在酸堿和貧瘠的土壤均能生長；含蛋白豐富可用于飼喂家畜［3—4］；固氮能力強，是良好的綠肥［5—6］，可與農作物輪作以增加產量［7］；花期時間長，是良好的蜜源植物；其根系發(fā)達、植株高大，具有防風固沙、保持水土的作用［4］。

目前我國對豆科牧草飼料的利用主要集中在紫花苜蓿（Medicago sativa）、紅豆草（Onobrychisviciaefolia）等植物，對草木樨利用較少，主要因為草木樨含有較高的香豆素。香豆素在霉菌的作用下轉化為雙香豆素，嚴重影響了草木樨的適口性而且家畜攝入過多后會出現(xiàn)敗血癥等癥狀［2，8—9］。而對于草木樨中香豆素的研究主要在分子方面，如分子標記，基因功能驗證等［10—12］；且國內外對于草木樨的育種工作主要集中在產量、耐鹽性等方面［13］，所以對于草木樨香豆素含量的研究十分滯后，國內尚無育成低香豆素的草木樨品種。為了提高草木樨的飼用價值，緩解當前的飼草短缺問題，促進草牧業(yè)的發(fā)展，培育出優(yōu)質高產的草木樨新品種十分必要［2］。

自2011年以來，蘭州大學草地農業(yè)科技學院在甘肅省榆中縣和臨澤縣完成了從美國國家植物種質資源庫（National Plant Germplasm System，NPGS）［14—15］引進的50份白花草木樨種質資源評價，并選擇出4份白花草木樨優(yōu)良種質作為親本材料，通過自由雜交方式創(chuàng)制出25份半同胞家系。駱凱［14］及Luo等［16］于2014年開展了第一次輪回選擇，對半同胞家系進行產量、香豆素含量等6個指標的綜合評價。要想育成穩(wěn)定的新品種，有必要開展多次輪回選擇。因此，本研究將對白花草木樨開展第二次輪回選擇，對25份半同胞家系在榆中和臨澤兩個試驗地點連續(xù)開展兩年的評價，測定指標包括產量、品質和香豆素含量等12個農藝性狀，并分析農藝性狀的遺傳變異，為進一步選育高產、優(yōu)質新品系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗材料為白花草木樨第二次輪回選擇的25份半同胞家系［16］。試驗于2018、2019年在甘肅省臨澤縣蘭州大學草地農業(yè)試驗站（100°02′E，39°15′N）和榆中縣試驗田進行（104°09′E，35°57′N）［14］。試驗采用完全隨機區(qū)組設計，試驗材料分別在兩個試驗點設置3個重復，每個重復保苗25株。

1.2 測定性狀及方法

株高（plant height，PH）、莖粗（stem diameter，SD）、干重（dry weight，DW）、葉莖比（leaf：stem ratio，LSR）、分枝數（stem number，SN）、白粉病感病等級（powdery mildew rate，PM）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌木質素（acid detergent lignin，ADL）、酸不溶性灰分（acid-insoluble ash，AIA）根據Luo等［16］的方法測定；采用凱氏定氮法測定粗蛋白（crude protein，CP）［17］含量；使用安捷倫1100型高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國）測定香豆素（coumarin，Cou）［18］含量。每個重復隨機取3株進行指標測定。

1.3 數據分析

采用Excel 2016整理原始數據，使用專業(yè)育種軟件DeltaGen進行遺傳方差分析、模式分析、表型相關性分析、狹義遺傳力、遺傳增益等分析，具體操作參見馬甜甜等［19］和Jahufer等［20］的方法。

使用DeltaGen［19—20］軟件中的Reml混合線性模型對半同胞家系進行遺傳方差分析，模型表示為：

式中：Y ijk表示性狀的觀測值；M為平均值；gi為不同半同胞家系的基因型效應；lj為不同試驗地點的固定效應；r jk為不同重復間的隨機效應；（gl）ij為地點與基因型的互作效應；εijk為總的殘差效應［14］。

使用DeltaGen軟件進行以兩試驗點間25份半同胞家系各個性狀的BLUP值為基礎的主成分分析和聚類分析相結合的模式分析［21］，圖像化地表示各家系和性狀的關系［14］。親本將性狀傳遞給子代的能力及程度可用遺傳力和遺傳增益表示，其相關公式參考Luo等［16，22］的方法。

2 結果與分析

2.1 方差分析

25份F2代白花草木樨半同胞家系在榆中和臨澤兩地區(qū)各性狀平均值和變化范圍及狹義遺傳力如表1～2所示，結果表明試驗材料有較大的表型差異。榆中地區(qū)白花草木樨的株高和干重的范圍分別為70～120 cm、34.3～145.0 g·plant—1，臨澤地區(qū)株高和干重分別為109～158 cm、44.1～224.7 g·plant—1。榆中地區(qū)的各性狀遺傳力范圍為0.34～0.81，干重、株高、莖粗的遺傳力分別為0.71、0.73、0.71；臨澤地區(qū)各性狀遺傳力范圍為0.43～0.86，干重、粗蛋白、香豆素含量的遺傳力分別為0.73、0.43、0.70.

表1 榆中地區(qū)白花草木樨半同胞家系各性狀基因型方差組分Table 1 The genotypic variance component of half-sib families traits of M.albus at Yuzhong

方差分析表明，榆中地區(qū)白花草木樨的株高、干重、莖粗、葉莖比表現(xiàn)出顯著的基因型變異（P＜0.05），白粉病感病等級和分枝數在各半同胞家系間沒有表現(xiàn)出顯著差異（表1）；臨澤地區(qū)所有產量性狀表現(xiàn)出顯著的基因型差異，品質性狀中除酸不溶性灰分和粗蛋白，其余各性狀表現(xiàn)出顯著的基因型差異（P＜0.05）（表2）。從榆中—臨澤兩地區(qū)聯(lián)合分析（表3）可以看出，除分枝數以外，其他各產量性狀存在基因型×環(huán)境顯著互作（P＜0.05）。

表2 臨澤地區(qū)白花草木樨半同胞家系各性狀基因型方差組分Table 2 The genotypic variance component of half-sib families traits of M.albus at Linze

表3 基因型×環(huán)境互作下白花草木樨半同胞家系各性狀的遺傳方差組分Table 3 The genotypic var iance component of half-sib families traits of M.albus under genotype-by-location interaction

2.2 模式分析

根據榆中—臨澤兩地半同胞家系各性狀的BLUP值生成的主成分圖（圖1）表明干重與粗蛋白呈正相關關系，與香豆素呈負相關關系；香豆素與葉莖比、粗蛋白呈正相關關系。干重與白粉病感病等級呈負相關關系。各性狀及家系的主成分分析結果表明第一主成分解釋了遺傳變異的26.1%，第二主成分解釋了遺傳變異的20.6%。聚類分析將這25份白花草木樨半同胞家系分為4個組（表4），其中第4組6個成員綜合表現(xiàn)最好，其香豆素平均含量最低為0.35%，平均干重最高為106.74 g·plant—1，白粉病感染程度最輕為1.27；第3組的兩個成員平均干重最低為59.11 g·plant—1，香豆素含量為0.47%，粗蛋白含量為12.12%，其表現(xiàn)較差。

表4 白花草木樨聚類分組信息和組內性狀均值Table 4 The group information and the average of traits within group of M.albus

2.3 相關性分析

相關性分析結果能準確表示性狀間的相關性及顯著水平。相關系數如表5所示，可以看出莖粗與干重、株高之間存在極顯著（P＜0.01）的正相關關系；株高與葉莖比呈極顯著（P＜0.01）的負相關關系；酸性洗滌纖維分別與酸性洗滌木質素、酸不溶性灰分呈極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）的正相關關系；粗蛋白與酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維存在極顯著（P＜0.01）的負相關關系。干重、粗蛋白、香豆素含量三者之間的相關關系與圖1結果反映一致。

表5 兩地點的白花草木樨性狀間的表型相關系數Table 5 Phenotypic correlation coeff icients between M.albus traits across two locations

圖1 白花草木樨各性狀主成分分析Fig.1 Principal component analysis of traits of M.albus

2.4 遺傳增益預估

遺傳增益是根據半同胞家系間各性狀基因型與環(huán)境互作的遺傳方差而進行預估的值。從表6可知，干重、粗蛋白、香豆素含量的遺傳增益增加百分比分別為4.3%、1.64%、—11.51%，產量性狀上遺傳增益增加百分比大小依次為干重、葉莖比、分枝數、莖粗、株高；干重遺傳增益增加百分比最多，而香豆素遺傳增益增加百分比為負值。

表6 基于兩地點評價半同胞家系的性狀經過一個選擇周期獲得的預期遺傳增益Table 6 Predicted genetic gain（ΔG）of per selection cycle in response to direct single trait selection based on the half-sib families evaluated across two locations

3 討論

植物的性狀表現(xiàn)是由基因和環(huán)境相互作用形成的［23］。目前有充分的證據表明，只要種質資源中存在遺傳變異，選擇適當的環(huán)境和性狀就可以通過植物育種成功地改良種群［24］。Caradus［25］在白三葉（Trifolium repens）育種中發(fā)現(xiàn)產量相關的性狀對環(huán)境與基因型的相互作用很敏感。Jahufer等［26］在新西蘭利用同樣的原理對26份白三葉草進行遺傳改良。Luo等［16］在榆中和臨澤地區(qū)的白花草木樨半同胞家系進行第一次選擇評價時，發(fā)現(xiàn)株高、莖粗等農藝性狀有顯著的基因型差異和較大的重復力［10］。這充分表明試驗材料具有培育出低香豆素新品種的潛質，同時也為白花草木樨后續(xù)的評價工作奠定了基礎。

本研究在臨澤和榆中兩個不同氣候環(huán)境中對白花草木樨半同胞家系進行第二次輪回選擇，進一步挖掘育種材料的潛力，提升育種進度。產量是植物育種工作的首要目標，從表1～2可知臨澤地區(qū)干重與株高等產量及遺傳力大小表現(xiàn)優(yōu)于榆中地區(qū)，因此選擇臨澤地區(qū)的試驗材料進行了品質相關指標和香豆素含量的測定。本研究表明第二次輪回選擇的25份白花草木樨半同胞家系在榆中和臨澤地區(qū)的干重、株高等產量性狀變化范圍較大，且具有顯著的遺傳變異和基因與環(huán)境互作，表明半同胞家系存在性狀分離，具有進一步優(yōu)化選擇的潛力。

要在多個性狀中進行優(yōu)化選擇，就必須了解各性狀間的關聯(lián)。本研究采用表型和基因型結合模式分析檢驗了所測性狀之間的關聯(lián)。產量的高低跟多個因素有關，干重與莖粗、株高、分枝數、葉莖比相關性依次減弱，表明本研究所選指標充分表征了材料產量高低。ADF、NDF等纖維指標與分枝數有著密切的相關關系，說明纖維含量主要由分枝數決定；而產量指標又分別與粗蛋白和纖維呈正相關，表明可以在追求產量的同時提高品質。許瑾等［8］研究表明白花草木樨葉片中香豆素含量為1.75%～1.82%，莖中為0.61%～0.97%。香豆素作為草木樨中需要減少的次級代謝物質，與葉莖比這個食物消化率和采食量的指標存在正相關關系，這可能是因為白花草木樨葉片中香豆素含量高于莖中，同時表明葉莖比可以作為反映香豆素含量的一個指標。香豆素與產量性狀存在著負相關關系；品質與產量、香豆素含量有正相關關系，這種關系成為本研究選擇育種成功的關鍵，說明在白花草木樨中香豆素、產量、品質三者間的關系可以進一步的選擇優(yōu)化，使第二次輪回選擇白花草木樨半同胞家系的評價工作有效彌補品質方面的不足。Jahufer等［27］研究柳枝稷（Panicum virgatum）產量、木質素、乙醇時，使用類似的方法有效地提高了柳枝稷的利用價值。

主成分與聚類分析的結合模式分析已被應用于概括復雜環(huán)境的基因型與性狀的關系。Davodi等［28］利用模式分析方法，從12個性狀出發(fā)，對200份紫花苜蓿種質資源的表現(xiàn)進行了綜合分析，以期對紫花苜蓿的產量和品質進行改良。本研究模式分析結果（圖1，表4）表明第一、二主成分解釋了遺傳變異的46.7%，并將株高、干重等12個性狀的相關關系以及25份材料在各性狀上的表現(xiàn)進行圖像化匯總。根據各性狀混合線性模型預測BLUP平均值，使用歐式距離方法將表現(xiàn)相似的半同胞家系聚為一類，從聚類的4組表現(xiàn)來看，第4組有6個成員可以作為后續(xù)的育種備選材料。駱凱［14］第一次輪回選擇后，測得香豆素含量最高為1.11%，最低為0.21%，平均值為0.50%，與第一次輪回選擇白花草木樨半同胞家系相比，第二次輪回選擇后香豆素含量平均值為0.44%，總體含量有所降低。為了進一步驗證對第二次輪回選擇半同胞家系的選擇評價效果，在20%的選擇壓力下估算了每個性狀的遺傳增益，這25份F2白花草木樨半同胞家系經過一個周期的輪回選擇在產量上有所提高，說明經過評價選擇后產量和品質有所增加，香豆素含量有所降低。這為后續(xù)的育種工作奠定了基礎。

4 結論

草木樨具有諸多優(yōu)良牧草特性，但其香豆素含量影響了飼用價值。在甘肅省榆中縣和臨澤縣對25份白花草木樨半同胞家系進行第二次輪回選擇，使草木樨的產量、品質提高的同時降低香豆素含量，說明白花草木樨具有很大的育種前景。