張文武，邱峰芳，許繼國(guó)

（1.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究所/江西地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330029）

【研究意義】了解物種內(nèi)和物種間表型多樣性的遺傳基礎(chǔ)是現(xiàn)代生物學(xué)研究的重大挑戰(zhàn)之一。家雞經(jīng)過(guò)數(shù)千年的選擇性繁殖聚集了豐富的表型變異，是研究和理解表型多樣性遺傳基礎(chǔ)的重要研究材料?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雞冠作為易見(jiàn)的裝飾性狀，無(wú)論在為人類(lèi)提供肉蛋的商業(yè)化品種還是作為觀(guān)賞用品種上，均受到強(qiáng)烈的人工選擇［1］。作為雞的第二性征，雞冠與性成熟之間的關(guān)系已經(jīng)得到很好的研究?？茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)雞冠與交配決策、社會(huì)等級(jí)、體溫調(diào)節(jié)、生殖能力和骨量有重要關(guān)系［2-7］。研究表明，多因子調(diào)控雞冠不同形態(tài)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已鑒定到與雞冠發(fā)育相關(guān)的候選基因有BMP2基因和CHADL基因［8-9］。三叉冠是單冠后端兩側(cè)分裂出肉質(zhì)隆起，形態(tài)像叉狀（圖1）。Pearl 等［10］最早提出三叉冠性狀，認(rèn)為三叉冠是純單冠和純豆冠的中間態(tài)。有學(xué)者通過(guò)白來(lái)航雞的雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)常染色體上有兩對(duì)等位基因控制單冠和分叉，但試驗(yàn)群體不大，其結(jié)論仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證［11］。有學(xué)者通過(guò)雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三叉冠基因型為Sss1s1、SSs1s1、ssS1S1、ssS1s1和sss1s1，非三叉基因型為SSS1S1、SsS1S1、SSS1s1和SsS1s1最符合交配試驗(yàn)后代的分布比例，但該假設(shè)未能很好解析左叉和右叉等冠型的遺傳規(guī)律，推測(cè)三叉冠是多基因遺傳控制的性狀［12］。目前對(duì)其他冠型方面的研究成果很多，有研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)齒冠寧都黃公雞的AR與VIPR1 蛋白免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著低于其他冠型個(gè)體，倒冠個(gè)體的AR 與VIPR1 蛋白的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞比率均顯著高于其他冠型個(gè)體，并且在雞冠竇狀血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞及生發(fā)層細(xì)胞中具有較高免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)［13］。研究人員發(fā)現(xiàn)玫瑰冠純合子的公雞個(gè)體生育能力較低［14］。攜帶豆冠等位基因的個(gè)體其肉垂也比較小且龍骨皮膚變厚［15］。由于進(jìn)化保守區(qū)的重復(fù)導(dǎo)致SOX5基因的異位表達(dá)，而異位表達(dá)的SOX5基因又改變了SSH基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致雞冠異常發(fā)育［16］。Somes［17］認(rèn)為該基因座位還存在一種控制蝴蝶冠的等位基因，其顯隱性位于V 形冠等位基因（DV）和雙冠等位基因（DC）之間?；蚪M重復(fù)與雞胚雞冠和兩種雙雞冠表型的異位異胚層表達(dá)有關(guān)［18］。

圖1 白耳黃雞三叉冠性狀Fig.1 Trigeminal comb traits of white-ear yellow chickens

【本研究切入點(diǎn)】隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)步，玫瑰冠、豆冠和雙冠等主要冠型的致因突變已經(jīng)鑒定且性狀形成機(jī)制也已被初步闡明，但目前尚無(wú)有關(guān)三叉冠性狀的分子遺傳學(xué)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，白耳黃雞群體有約5%的個(gè)體為三叉冠。本研究以白耳黃雞為研究材料，采用雜交實(shí)驗(yàn)、受精率實(shí)驗(yàn)和全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide Association Analysis,GWAS）對(duì)白耳黃雞三叉冠性狀進(jìn)行分析，以期為三叉冠的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試白耳黃雞來(lái)自江西省上饒市廣豐區(qū)白耳黃雞原種場(chǎng)。供試白耳黃雞的飼養(yǎng)管理流程按原種場(chǎng)管理；飼料營(yíng)養(yǎng)方面，育雛階段（1～30 日齡）飼喂正大慢速品種小雞料，育成階段（30～170 日齡）飼喂正大育成料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正反交試驗(yàn)和受精率試驗(yàn) 以60 只120 日齡的白耳黃雞進(jìn)行正反交試驗(yàn)，15 只三叉冠公雞與15 只單冠母雞交配，以及15 只單冠公雞與15只三叉冠母雞交配。以120 只120 日齡的白耳黃雞進(jìn)行受精率試驗(yàn)，30 只單冠公雞和30 只三叉冠公雞分別與30 只單冠母雞交配。

1.2.2 GWAS 分析 對(duì)82 只150 日齡的白耳黃公雞（23 只三叉冠、23 只單冠）于翅靜脈采血各5 mL，用EDTA 抗凝處理，提取基因組DNA 用于GWAS 分析。基因分型采用Illumina 平臺(tái)的雞京芯一號(hào)60 k 芯片。數(shù)據(jù)質(zhì)控使用PLINK 1.90 軟件?；蛐唾|(zhì)控過(guò)程將刪除達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體或位點(diǎn)：分型缺失數(shù)＞10%的位點(diǎn)、最小等位基因頻率＜ 0.01 的位點(diǎn)和哈代-溫伯格檢驗(yàn)P值＜1×10-4的位點(diǎn)。

在GWAS 分析中，試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性部分來(lái)自群體分層［19］。主成分分析（PCA）方法能用于遺傳學(xué)的聚類(lèi)分析，根據(jù)遺傳差異可將個(gè)體分為不同亞組。本研究采用PCA 方法進(jìn)行群體分層分析，使用GCTA 軟件對(duì)有效SNP 進(jìn)行PCA，獲得基因組數(shù)據(jù)特征值和特征向量，并用R 程序作PCA 圖。GWAS 分析采用混合線(xiàn)性模型GEMMA。采用Bonferroni 多重檢驗(yàn)方法確定關(guān)聯(lián)顯性閾值，閾值為1/有效SNP 位點(diǎn)數(shù)量。

在NCBI 網(wǎng)站上下載對(duì)應(yīng)物種的參考基因組信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/111?genome_assembly_id=1543395），使用ANNOVAR 軟件將顯著SNP 注釋到其對(duì)應(yīng)的基因上，并結(jié)合文獻(xiàn)注釋候選基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 白耳黃雞三叉冠表型遺傳方式

用三叉冠白耳黃雞個(gè)體與單冠白耳黃雞個(gè)體進(jìn)行正反交試驗(yàn)，結(jié)果（表1）顯示后代全為單冠。在遺傳雜交試驗(yàn)中通常采用正交和反交來(lái)判斷某性狀的基因是位于常染色體上還是性染色體上。根據(jù)后代全為單冠初步推測(cè)，白耳黃雞三叉冠為常染色體遺傳。

表1 白耳黃雞正反交試驗(yàn)Table 1 Orthogonal and reverse cross tests of white-ear yellow chickens

2.2 單冠和三叉冠白耳黃雞的種蛋受精率比較

比較30 只單冠公雞和30 只三叉冠公雞與配單冠母雞的受精能力，結(jié)果顯示，與配單冠群體的種蛋受精率為94.9%（258/272），與配三叉冠群體的種蛋受精率為92.7%（241/260），差異不顯著。

2.3 白耳黃雞群體有效SNP 數(shù)和群體結(jié)構(gòu)分析

GWAS 分析首先要對(duì)基因型及表型進(jìn)行一定標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控，以排除異?；蛐秃彤惓１硇蛯?duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響。經(jīng)質(zhì)控白耳黃雞群體得到55 023 個(gè)有效SNP。通過(guò)對(duì)標(biāo)記矩陣進(jìn)行PCA 分析，提取解釋方差最大的前幾位PCA，繪制對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖可反映群體結(jié)構(gòu)。從圖2 可以看出，白耳黃雞群體的點(diǎn)相對(duì)集中，表明白耳黃雞群體內(nèi)不存在明顯的群體分層，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 白耳黃雞群體結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Population structure analysis of white-ear yellow chickens

2.4 白耳黃雞三叉冠顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)分析

圖3 和圖4 分別是對(duì)白耳黃雞三叉冠GWAS分析所得結(jié)果的QQ 圖和曼哈頓圖。QQ 圖中X軸和Y 軸分別為期望的P值和實(shí)際的P值，兩者一致時(shí)，由隨機(jī)漂變導(dǎo)致；兩者不一致時(shí)，存在真實(shí)變異，對(duì)應(yīng)的點(diǎn)與表型相關(guān)。在曼哈頓圖中每個(gè)基因組SNP 位點(diǎn)沿染色體序列排列，Y 軸的P值可理解為每個(gè)SNP 與表型的關(guān)聯(lián)程度。結(jié)果（表2）顯示，與白耳黃雞三叉冠顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)共有10 個(gè)，其中有1 個(gè)SNP 位于第1 號(hào)染色體，2 個(gè)SNP 位于第2 號(hào)染色體，2 個(gè)SNP 位于第3 號(hào)染色體，1 個(gè)SNP 位于第4 號(hào)染色體，1 個(gè)SNP 位于第5 號(hào)染色體，1 個(gè)SNP 位于第12 號(hào)染色體，2 個(gè)SNP 位于第14 號(hào)染色體。這10 個(gè)SNP 分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A、MAPK8IP3基因上。

圖3 白耳黃雞三叉冠關(guān)聯(lián)分析QQ 圖Fig.3 QQ plot of association analysis of white-ear yellow chicken with trigeminal comb

圖4 白耳黃雞三叉冠關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.4 Manhattan diagram of association analysis of white-ear yellow chicken with trigeminal comb

表2 白耳黃雞三叉冠顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)Table 2 SNP loci significantly associated with trigeminal comb of white-ear yellow chicken

3 討論

3.1 白耳黃雞三叉冠遺傳方式

在遺傳雜交試驗(yàn)中通常采用正交和反交來(lái)判斷某性狀的基因位于常染色體上還是性染色體上。有學(xué)者通過(guò)白色來(lái)航雞的雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)常染色體上有兩對(duì)等位基因控制單冠和分叉冠［11］。有學(xué)者通過(guò)雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三叉冠基因型是常染色體多基因遺傳控制的性狀［12］。本研究發(fā)現(xiàn)白耳黃雞三叉冠呈現(xiàn)常染色體遺傳，這與前人研究結(jié)果相一致。

3.2 白耳黃雞三叉冠與受精率的關(guān)系

有研究報(bào)道，玫瑰冠與豆冠、單冠的精子活率和受精率差異不顯著，但玫瑰冠與單冠在精子密度和受精蛋孵化率上顯著高于豆冠［20］。有學(xué)者研究玫瑰冠個(gè)體的精液質(zhì)量與不同基因型個(gè)體的生育能力和生育持續(xù)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)精子活力缺陷是導(dǎo)致低生育能力以及生育時(shí)間短的原因［21］。但還未有研究三叉冠與受精率關(guān)系的報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)與配三叉冠公雞的母雞群體的種蛋受精率低于與配單冠公雞個(gè)體，但差異不顯著，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

3.3 白耳黃雞三叉冠的GWAS 分析

在雞生產(chǎn)中，GWAS 被用來(lái)鑒定與生產(chǎn)相關(guān)性狀的候選基因。本研究對(duì)白耳黃雞三叉冠進(jìn)行GWAS 分析，檢測(cè)到10 個(gè)顯著SNP，分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A和MAPK8IP3基因上。但根據(jù)前人研究結(jié)果［22-36］，這些基因并非與白耳黃雞三叉冠形成直接相關(guān)的候選基因。

4 結(jié)論

本研究對(duì)白耳黃雞三叉冠性狀進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，白耳黃雞三叉冠呈現(xiàn)常染色體遺傳；GWAS 分析發(fā)現(xiàn)10 個(gè)與白耳黃雞三叉冠顯著關(guān)聯(lián)的SNP，分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A、MAPK8IP3基因上，但這些基因并非與白耳黃雞三叉冠形成直接相關(guān)的候選基因，這些基因是否參與三叉冠的形成需要進(jìn)一步證實(shí)。