李麗麗， 曹磊， 王際宇， 王瑞丹， 毛文文， 侯娟， 李翔， 朱華玉， 李瓊， 胡建斌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

冷脅迫是自然界中廣泛存在的一種重要的非生物逆境，主要分為冷害和凍害兩類(lèi)。冷害指0 ℃以上的低溫，可導(dǎo)致植物細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生變化、活性氧積累和代謝紊亂；而凍害指0 ℃以下的低溫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成一些小冰晶，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損，植株表現(xiàn)出脫水癥狀[1]。為了應(yīng)對(duì)環(huán)境的冷脅迫，植物進(jìn)化出了一系列復(fù)雜的冷響應(yīng)機(jī)制，以減少低溫逆境對(duì)自身的傷害。研究表明，低溫脅迫可激活一系列冷響應(yīng)相關(guān)基因[COR(cold-regulated)、LTI(low temperature-induced)、RAB(responsive to abscisicacid)、KIN(cold-inducible)、RD(responsive to desiccation)、ERD(early dehydration-inducible) ]等的表達(dá)，從而啟動(dòng)植物自身的低溫防御系統(tǒng)，增強(qiáng)植物的耐冷性[2-3]。CBF轉(zhuǎn)錄因子作為冷信號(hào)途徑中的中心樞紐或“分子開(kāi)關(guān)”，在植物響應(yīng)冷脅迫過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是高等植物中保守存在的冷響應(yīng)調(diào)控因子[4]。目前，依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路研究較為透徹，CBF可直接結(jié)合下游靶基因(如COR等基因)啟動(dòng)子，通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄參與調(diào)節(jié)植物耐冷性；同時(shí)，CBF基因的轉(zhuǎn)錄活性也受到上游調(diào)控因子的調(diào)控[4-5]。例如，擬南芥CBFs基因啟動(dòng)子上的順式作用元件十分豐富，包括EE、G-box、CarG box、E-box、MYB、CBS、BRRE、MYC、LTR等，許多轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別這些元件，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥CBFs轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控[6]。近期研究表明，CBF基因上游調(diào)控因子[如ICE(inducer of CBF expression)]的磷酸化、泛素化、類(lèi)泛素化等翻譯后修飾在ICE-CBF-COR信號(hào)通路中普遍存在，精細(xì)調(diào)控CBF的轉(zhuǎn)錄活性，從而使植株更好地適應(yīng)環(huán)境中的低溫逆境[7]。本研究針對(duì)近期發(fā)現(xiàn)的CBF上游調(diào)控因子及其翻譯后修飾進(jìn)行分析和討論，以期深化對(duì)植物冷響應(yīng)機(jī)制的理解。

1 CBF基因家族及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

CBF基因家族是一類(lèi)包含AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive)DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠與COR基因啟動(dòng)子區(qū)域CRT/DRE(C-repeat/dehydration response element)元件CCGAC結(jié)合，調(diào)控COR基因的轉(zhuǎn)錄活性[8]。擬南芥CBF基因家族有4個(gè)成員，其中CBF1(DREB1B)、CBF2(DREB1C)和CBF3(DREB1A)在第4染色體上串聯(lián)排列，參與調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)冷脅迫[8-9]，而CBF4則參與調(diào)控?cái)M南芥的耐旱性[10]。CBF1、CBF2和CBF3的氨基酸序列相似性極高(>85%)，可能起源于同一基因。過(guò)量表達(dá)CBF1、CBF2和CBF3基因均能提高植株的耐冷性，并誘導(dǎo)植株體內(nèi)COR、RD等基因的表達(dá)[11]，說(shuō)明它們?cè)谥参锬屠湫赃z傳改良中具有潛在利用價(jià)值。

對(duì)擬南芥CBF的蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，CBF屬于AP2/ERF家族的一個(gè)亞家族，擬南芥中該亞家族有145個(gè)成員[12]。CBF蛋白除了含有AP2/ERF DNA結(jié)合域之外，還含有2個(gè)高度保守的氨基酸序列，即PKKP/PKKPAGR(RAGRxxKFxETRHP)和 DSAWR，這兩個(gè)序列分別位于AP2/ERF結(jié)合域的上游和下游。分子生物學(xué)試驗(yàn)證明，擬南芥CBF1的PKKPAGR序列對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要，該序列的突變削弱了CBF1蛋白與COR15a基因啟動(dòng)子上DNA識(shí)別元件(CRT/DRE)結(jié)合的能力，降低了COR15a基因表達(dá)，植株表現(xiàn)出對(duì)冷脅迫更加敏感[12]，說(shuō)明PKKPAGR基序?qū)BF蛋白行使轉(zhuǎn)錄因子功能極為重要。

2 CBF基因的生物學(xué)功能

植物冷信號(hào)通路可劃分為2類(lèi)，即依賴(lài)于CBF和不依賴(lài)于CBF的信號(hào)通路。其中，依賴(lài)于CBF的信號(hào)通路是一種復(fù)雜的冷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要通過(guò)ICE1-CBF-COR級(jí)聯(lián)模式調(diào)控植物耐冷性[5-7]。當(dāng)植物遭遇冷脅迫時(shí)，ICE1轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到CBF啟動(dòng)子區(qū)域，激活CBF下游COR等基因的轉(zhuǎn)錄，快速響應(yīng)冷脅迫，增強(qiáng)植物的耐冷性。除ICE1之外，還有一些轉(zhuǎn)錄因子(如MYB)與CBF的啟動(dòng)子結(jié)合，參與冷脅迫下CBF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4-6]。

CBF基因主要在植物遭遇冷脅迫的初期發(fā)揮功能，能夠使植物迅速響應(yīng)冷脅迫。在擬南芥中，CBF1/2/3的轉(zhuǎn)錄活性在冷處理15 min就被激活，之后轉(zhuǎn)錄水平迅速升高，在3 h達(dá)到峰值，而CBF基因的下游靶基因COR的轉(zhuǎn)錄水平在處理的2 h開(kāi)始升高[8]。盡管CBF1/2/3功能相似，但表達(dá)模式卻不完全相同。NOVILLO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CBF2突變體比冷馴化前后的野生型的耐冷性更強(qiáng)，冷處理后cbf2突變體CBF1和CBF3的表達(dá)量顯著升高，且CBF1和CBF3的表達(dá)時(shí)間要早于CBF2。此結(jié)果說(shuō)明，擬南芥CBFs基因之間存在著負(fù)向反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，即CBF2可以負(fù)調(diào)控CBF1和CBF3的表達(dá)，從而共同調(diào)控下游冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。然而，CBF1和CBF3的啟動(dòng)子上并沒(méi)有CBF2的結(jié)合位點(diǎn)[14]，說(shuō)明CBF2并非直接調(diào)控CBF1和CBF3。CBF2調(diào)控CBF1和CBF3的分子機(jī)制目前還不清楚。與CBF2不同的是，CBF1和CBF3不參與調(diào)節(jié)其他CBFs基因的表達(dá)，二者通過(guò)一種協(xié)同的加性效應(yīng)方式，正向調(diào)控植物的耐冷性[14]。

CBF基因廣泛存在于有花植物中，在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性，單子葉和雙子葉植物的CBF基因均與低溫脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。在單子葉植物中，過(guò)表達(dá)玉米ZmDREB1A(與擬南芥DREB1s/CBFs同源)能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和耐冷性[15]，在擬南芥中異源表達(dá)水稻OsDREB1A和OsDREB1B能顯著提高植株的耐冷性，在水稻中過(guò)表達(dá)OsDREB1能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[16]。在雙子葉植物番茄中也鑒定到3個(gè)CBF基因(LeCBF1/2/3)，與擬南芥中的情況相似，LeCBF1/2/3在基因組上呈串聯(lián)排列。在擬南芥中異源表達(dá)LeCBF1能夠誘導(dǎo)下游靶基因COR的表達(dá)，從而提高擬南芥的耐冷性[17]。然而，在番茄中過(guò)表達(dá)LeCBF1或AtCBF3基因則不能增強(qiáng)植株的耐冷性[17]，在番茄中異源表達(dá)甜瓜CmCBF1反而降低轉(zhuǎn)基因番茄的耐冷性和葉片脯氨酸、可溶性糖等抗逆物質(zhì)的含量[18]，說(shuō)明依賴(lài)于CBF冷信號(hào)調(diào)控途徑在番茄和擬南芥中差異較大。以上結(jié)果說(shuō)明，CBF基因在單子葉、雙子葉植物中具有高度保守性，但在不同物種中其生物學(xué)功能存在一定差異。

3 CBF基因的上游調(diào)控因子

CBF基因通過(guò)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物響應(yīng)冷脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而作為冷信號(hào)通路的中心樞紐，CBF基因的轉(zhuǎn)錄活性也受各種上游調(diào)控因子精準(zhǔn)調(diào)控。這些調(diào)控因子可分為2大類(lèi)，即正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子(表1)。正調(diào)控因子包括ICE1/2、CAMTA3/5、CESTA、BZR1/BES1、CCA1/LHY、IPA1等基因，他們能夠激活CBF及其下游冷信號(hào)靶基因表達(dá)，增強(qiáng)植株的耐冷性；而bZIP52/68、PIF3/4/7、EIN3、SOC1、TOC1、PRR5/7/9等則抑制CBF基因的轉(zhuǎn)錄及下游靶基因的表達(dá)，使植株對(duì)冷敏感，屬于負(fù)調(diào)控因子。此外，MYB15基因在不同物種中調(diào)控方式不一致。部分CBF基因的上游調(diào)控因子(轉(zhuǎn)錄因子)還存在翻譯后修飾，包括磷酸化、泛素化、類(lèi)泛素化等(表1)，參與調(diào)控因子活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，從而有效調(diào)控植株應(yīng)對(duì)環(huán)境的低溫脅迫。

表1 冷信號(hào)通路中CBF基因的調(diào)控因子Table 1 Regulators of the CBF genes in cold signal pathway

4 CBF上游調(diào)控因子的調(diào)控方式

4.1 正向調(diào)控方式

4.1.1 ICE轉(zhuǎn)錄因子家族 ICEs屬于MYC-like bHLH(basic helix-loop-helix)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中有2個(gè)成員ICE1和ICE2，且二者高度同源，均能結(jié)合到CBF1/2/3的啟動(dòng)子，激活CBFs基因表達(dá)[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下ICE1可結(jié)合到CBF1/2/3啟動(dòng)子的MYC結(jié)合位點(diǎn)，與MYB15(負(fù)調(diào)控CBF轉(zhuǎn)錄)競(jìng)爭(zhēng)該位點(diǎn)，形成占位效應(yīng)，抑制MYB15的負(fù)調(diào)控作用，從而促進(jìn)CBF及下游靶基因的表達(dá)[20]。此外還發(fā)現(xiàn)，突變體ice1表現(xiàn)出對(duì)低溫高度敏感，而ice2的耐冷性并無(wú)明顯變化，雙突變體ice1ice2中CBF1/2/3表達(dá)量顯著下降，植株耐冷性顯著降低，說(shuō)明ICE1和ICE2基因存在功能冗余[20]。但I(xiàn)CE1的功能更為保守，在水稻[21]、玉米[22]、番茄[23]等作物中，均可通過(guò)直接調(diào)控CBFs基因轉(zhuǎn)錄活性來(lái)增強(qiáng)植物的耐冷性。

近期研究表明，ICE1蛋白能夠被蛋白激酶OST1 (open stomata 1)[24]和MPK3/6[25-26]磷酸化修飾，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性，參與植物冷脅迫信號(hào)調(diào)控途徑。OST1是ABA信號(hào)通路中重要的Ser/Thr蛋白激酶，冷脅迫下OST1與ICE1互作并將ICE1磷酸化，增強(qiáng)ICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而提高植物的耐冷性[24]。在擬南芥中，MPK3和MPK6與ICE1互作并將其磷酸化，促使ICE1降解，進(jìn)而抑制CBFs基因表達(dá)，使植株對(duì)冷敏感[26]。而在水稻中，冷脅迫下蛋白激酶OsMPK3能夠磷酸化OsICE1，阻止E3泛素連接酶HOS1(high expression of osmotically responsive gene 1)對(duì)OsICE1的降解，同時(shí)增強(qiáng)OsICE1基因的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)植物的耐冷性[27]。因此，在不同物種中ICE1磷酸化修飾的作用方式并不一致，具有明顯的物種特異性。

此外，HOS1還能與ICE1/2蛋白互作，通過(guò)泛素化調(diào)控其在體內(nèi)和體外的降解，進(jìn)而影響CBFs的轉(zhuǎn)錄活性[28]。而HOS1與ICE1蛋白的互作又可被OST1所干擾，即OST1與ICE1的互作削弱了HOS1和ICE1之間的互作，從而抑制HOS1介導(dǎo)的ICE1在冷脅迫下的降解，維持CBFs的轉(zhuǎn)錄活性。MIURA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下E3連接酶SIZ1促使SUMO (small ubiquitin-related modifier)與ICE1蛋白底物的結(jié)合，導(dǎo)致ICE1蛋白發(fā)生類(lèi)泛素化(SUMO化)修飾，增強(qiáng)ICE1蛋白在冷脅迫下的穩(wěn)定性，其中ICE1的第393位賴(lài)氨酸殘基是識(shí)別SUMO偶聯(lián)的關(guān)鍵位點(diǎn)。

4.1.2 CAMTA轉(zhuǎn)錄因子家族 CAMTAs(calmodulin-binding transcription activators)是保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南芥有6個(gè)成員，其中CAMTA1、CAMTA2和CAMTA3關(guān)系最為密切，并且在CBF冷信號(hào)通路中功能冗余[30]。在冷誘導(dǎo)下，CAMTA3能快速結(jié)合到CBF1和CBF2啟動(dòng)子上，激活CBFs基因的轉(zhuǎn)錄，突變體camta3中CBF1和CBF2顯著下調(diào)表達(dá)，在雙突變體(camta1camta2、camta1camta3和camta2camta3)中CBF1、CBF2和CBF3基因均下調(diào)表達(dá)，但是CBF3下調(diào)量稍低，說(shuō)明CAMTA1/2/3主要調(diào)控CBF1和CBF2的轉(zhuǎn)錄。DOHERTY等[31]發(fā)現(xiàn)，CBF2啟動(dòng)子有7個(gè)保守的CM基序(CM1～CM7)，其中CM4和CM6具有負(fù)調(diào)控活性，CM2同時(shí)具有負(fù)調(diào)控和正調(diào)控活性。CAMTA3能夠與CM2基序結(jié)合，激活CBF2表達(dá)，正調(diào)控植物耐冷性。

自然界中冷脅迫有兩種方式：一種是環(huán)境溫度驟然下降，另一種是環(huán)境溫度逐漸下降。CAMTA3和CAMTA5只對(duì)溫度的快速下降作出反應(yīng)，能快速誘導(dǎo)CBFs的表達(dá)，而CAMTA1除了能響應(yīng)驟然降溫外，還受緩慢降溫的誘導(dǎo)[32]。說(shuō)明植物可通過(guò)行使CAMTA基因不同功能，響應(yīng)晝夜變溫(驟然降溫)和季節(jié)變溫(逐漸降溫)。

4.1.3 CESTA轉(zhuǎn)錄因子 CESTA(CES)為bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，是油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BRs)合成途徑的關(guān)鍵基因，BRs信號(hào)能夠?yàn)橹参锾峁┗A(chǔ)抗性，有助于植物的冷馴化。BRs和CES既能調(diào)控依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路，又能調(diào)控不依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路，以多種方式參與植株冷響應(yīng)調(diào)控。在依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路中，CES能夠結(jié)合到CBF1/2/3啟動(dòng)子上，激活CBFs基因及下游COR15A基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的耐冷性；而在不依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路中，CES蛋白可直接激活COR基因的表達(dá)[33]。

CES蛋白包含一個(gè)SUMO基序，BRs信號(hào)的激活可導(dǎo)致CES發(fā)生SUMO化[33]，而CES的SUMO化狀態(tài)能否參與調(diào)控CBF冷信號(hào)通路，這一問(wèn)題在很長(zhǎng)時(shí)間未得到解釋。KHAN等[34]設(shè)計(jì)了包含CES野生型(35S:CESwt-YFP，line 32)、CES SUMO化缺失株系(35S:CESK72R-YFP，line 411)、CES SUMO化增強(qiáng)株系(35S:CESS75A+S77A-YFP，line 310)等系列特殊試驗(yàn)材料，檢測(cè)了冷處理前后CBF的靶基因COR15A的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COR15A在CES SUMO化增強(qiáng)株系中的表達(dá)量顯著高于CES野生型，在CES SUMO化缺失株系中的表達(dá)量顯著低于CES野生型，并且CES SUMO化缺失株系比CES野生型冷害程度更嚴(yán)重，而CES SUMO化增強(qiáng)株系的冷害只是略低于CES野生型。此結(jié)果說(shuō)明，BRs 和CES參與依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路調(diào)控，CES蛋白SUMO化修飾有助于增強(qiáng)植株的耐冷性。

4.1.4 BZR1/BES1轉(zhuǎn)錄因子 BZR1(brassinazole resistant 1)和 BES1(BRI1 EMS suppressor)是BRs信號(hào)傳導(dǎo)中的2個(gè)重要成員，同CES一樣，BZR1也可以調(diào)控依賴(lài)于CBF和不依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路[35]。對(duì)BZR1和 BES1的結(jié)構(gòu)域激活突變體(bzr1-1D和bes1-D)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)冷馴化，bzr1-1D和bes1-D表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的耐冷性，說(shuō)明BZR1和BES1正調(diào)控植物耐冷性。蛋白互作試驗(yàn)證明，在依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路中，BZR1和 BES1能夠直接結(jié)合到CBF1/2啟動(dòng)子BRRE和E-box位點(diǎn)，激活CBFs基因的表達(dá)；此外，BZR1還可以調(diào)控不依賴(lài)于CBF冷信號(hào)通路的其他基因(WKRY6、PYL6、SOC1、JMT、SAG21等)表達(dá)，調(diào)節(jié)植物響應(yīng)冷脅迫[35]。

BZR1的磷酸化狀態(tài)在調(diào)控BRs信號(hào)通路響應(yīng)低溫等非生物脅迫中起著重要作用[36]。LI等[35]檢測(cè)冷處理不同時(shí)間點(diǎn)野生型BZR1蛋白表達(dá)量和磷酸化狀態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在冷處理前BZR1同時(shí)具有磷酸化和去磷酸化2種形態(tài)，且以磷酸化形態(tài)為主；隨著冷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BZR1的去磷酸化量逐漸增加，在冷處理3 h達(dá)到峰值，隨后下降，說(shuō)明冷處理促使BZR1蛋白由磷酸化狀態(tài)向去磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，植株對(duì)低溫響應(yīng)逐漸減弱。

4.1.5 CCA1/LHY轉(zhuǎn)錄因子 CCA1(clock-associated 1)和LHY(late hypocotyl)是2個(gè)關(guān)系密切的R1/R2型MYB轉(zhuǎn)錄因子，是植物生物鐘的核心結(jié)構(gòu)(中央振蕩器)重要組成成分，參與植物晝夜節(jié)律和光周期的調(diào)控，二者存在部分功能冗余[37]。DONG等[38]發(fā)現(xiàn)，CBF1/2/3的表達(dá)(包括冷誘導(dǎo))受晝夜節(jié)律調(diào)控。雙突變體cca1lhy的CBF1/2/3基因的冷誘導(dǎo)作用明顯減弱，CBF1/3的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)消失，CBF2的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)幅度也顯著降低；雙突變體中COR47和COR78基因的表達(dá)也顯著降低，植株變得對(duì)低溫敏感。CBFs基因的啟動(dòng)子CBS區(qū)域是CCA1/LHY結(jié)合位點(diǎn)。因此，CCA1/LHY通過(guò)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律參與CBFs基因冷信號(hào)通路，正調(diào)控植物的耐冷性。

4.1.6 IPA1轉(zhuǎn)錄因子IPA1(ideal plant architecture 1)編碼一個(gè)含有SBP-box結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控水稻理想株型的關(guān)鍵基因[39]。最近JIA等[40]研究發(fā)現(xiàn)，IPA1蛋白的磷酸化對(duì)提高水稻耐冷性具有重要作用。水稻應(yīng)激活化蛋白激酶SAPK6(osmotic stress/aba-activated protein kinase 6)能與IPA1互作，并在S201和S213兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)IPA1進(jìn)行磷酸化修飾，進(jìn)而維持IPA1蛋白的穩(wěn)定性。通過(guò)突變體ipa1S213N(IPA1蛋白S213位點(diǎn)無(wú)法被磷酸化)表型分析發(fā)現(xiàn)，該突變體對(duì)冷敏感，說(shuō)明IPA1的S213位點(diǎn)的磷酸化對(duì)于植株耐冷性表型具有關(guān)鍵作用；而磷酸化的IPA1蛋白能直接結(jié)合CBF3啟動(dòng)子GTAC基序上激活其基因表達(dá)，增強(qiáng)植株的耐冷性。這一研究是對(duì)IPA1基因功能的進(jìn)一步挖掘，揭示了該基因的應(yīng)用價(jià)值。

4.2 負(fù)向調(diào)控方式

4.2.1 PIFs轉(zhuǎn)錄因子 光敏色素互作因子PIFs(phytochrome-interacting factors)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需因子，也是整合多種內(nèi)外信號(hào)調(diào)控植物發(fā)育的核心部件。PIFs蛋白中保守的bHLH結(jié)構(gòu)域能特異性地與啟動(dòng)子中的G-box元件結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[41]。植物的CBF冷信號(hào)通路也受光周期調(diào)控[42]。PIF3是抑制植物光形態(tài)建成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)直接與CBF基因啟動(dòng)子結(jié)合，負(fù)調(diào)控CBF及下游靶基因的表達(dá)[43]。植物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，已經(jīng)能夠適時(shí)地調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)適應(yīng)環(huán)境中溫光變化。在溫暖的長(zhǎng)日照生長(zhǎng)期，PIF4和PIF7能夠抑制CBF信號(hào)通路，減少不必要能量和營(yíng)養(yǎng)分配，加速植株生長(zhǎng)發(fā)育；而在短日照條件下，PIF4和PIF7對(duì)CBF的轉(zhuǎn)錄抑制減弱，使植物能夠更好地應(yīng)對(duì)即將到來(lái)的低溫[42]。KIDOKORO等[44]發(fā)現(xiàn)，在光照條件下pif7突變體中DREB1B(CBF1)和DREB1C(CBF2)的表達(dá)沒(méi)有受到抑制，說(shuō)明在晝夜節(jié)律調(diào)控下，PIF7是CBF1和CBF2基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子。

PIF3基因的轉(zhuǎn)錄活性受泛素化修飾的調(diào)控。F-box型E3泛素連接酶EBF1和EBF2能與PIF3蛋白互作并將其泛素化，進(jìn)而通過(guò)26S蛋白酶體途徑將其降解。與野生型相比，突變體ebf1和ebf2對(duì)冷敏感，并且冷處理能促進(jìn)EBF1和EBF2的降解，增強(qiáng)PIF3蛋白的穩(wěn)態(tài)，抑制CBF基因的表達(dá)[43]。

4.2.2 bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族 bZIP是真核生物中分布最為廣泛、進(jìn)化上最為保守的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子分為13個(gè)亞家族，共有78個(gè)成員，具有調(diào)控植物發(fā)育、種子休眠、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫應(yīng)答等多種生物學(xué)功能[45]。

水稻bZIP52基因的表達(dá)受4 ℃低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。bZIP52能結(jié)合到CBF基因啟動(dòng)子的G-box基序上，同時(shí)也能形成同源二聚體，負(fù)調(diào)控水稻對(duì)低溫的耐受性[46]。而水稻bZIP家族另一成員bZIP73在粳稻進(jìn)化中受到強(qiáng)烈選擇，與bZIP71蛋白互作來(lái)調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)脫落酸(ABA)和活性氧(ROS)水平，從而調(diào)節(jié)水稻對(duì)低溫的耐受性[47]。在玉米中，bZIP68能夠抑制CBF信號(hào)途徑中多個(gè)COR基因的表達(dá)，是玉米響應(yīng)冷脅迫的負(fù)調(diào)控因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，bZIP68通過(guò)結(jié)合在DREB1s(CBFs)基因啟動(dòng)子A-box元件上，抑制DREB1s的表達(dá)，從而參與依賴(lài)于CBF的冷信號(hào)通路調(diào)控。細(xì)胞核中的激酶MPK8能直接磷酸化bZIP68的Ser250位點(diǎn)，促進(jìn)其在冷脅迫下的蛋白積累，增強(qiáng)bZIP68對(duì)下游靶基因DREB1啟動(dòng)子的結(jié)合。玉米與其祖先種大芻草在bZIP68啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)358bp的片段插入，該片段的插入使bZIP68在玉米中的表達(dá)量升高，并導(dǎo)致玉米的耐冷性下降[48]。此結(jié)果表明，在玉米馴化過(guò)程中bZIP68的耐冷優(yōu)勢(shì)等位變異并沒(méi)有被選擇利用，而保留在大芻草中的bZIP68耐冷優(yōu)勢(shì)等位變異能為玉米耐冷性分子育種提供基因靶點(diǎn)。

4.2.3 PRR基因家族PRRs(pseudo response regulators)基因是調(diào)控植物生物鐘的重要成員，在植物光周期控制開(kāi)花途徑中起抑制作用，并通過(guò)調(diào)控ABA等途徑影響植物非生物抗性。目前在擬南芥中鑒定出了5個(gè)PRR成員(PRR1/TOC1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)，水稻中也有5個(gè)直系同源基因(OsPRR1/OsTOC1、OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59和OsPRR95)，這5個(gè)基因在水稻冷處理后均顯著上調(diào)[49]。對(duì)雙突變體prr7prr9的研究發(fā)現(xiàn)，PRR7和PRR9可以調(diào)節(jié)CCA1和LHY響應(yīng)環(huán)境變溫；而三突變體prr5prr7prr9的DREB1/CBF基因表達(dá)量最高，耐冷性顯著增強(qiáng)，植株中棉子糖和脯氨酸的積累也達(dá)到了很高水平，因此PRR5/7/9通過(guò)調(diào)節(jié)包括DREB1/CBF在內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)基因來(lái)調(diào)控植物的耐冷性[50]。采用CHIP-Seq和ChIP-qPCR技術(shù)鑒定到PRR5蛋白的直接靶基因?yàn)榘珹P2/ERF結(jié)構(gòu)域的家族基因DREB1A、DREB1B和DREB1C，而PRR7/9也能直接結(jié)合到DREB1B和DREB1C的啟動(dòng)子CBS區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[51]。擬南芥中TOC1能夠直接結(jié)合到CBF3的啟動(dòng)子上抑制CBF3基因的轉(zhuǎn)錄[52]。

4.2.4 EIN3和SOC1轉(zhuǎn)錄因子 EIN3(ethylene insensitive3)是乙烯信號(hào)通路中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，與EIL1(EIN3-like1)共同擔(dān)負(fù)著乙烯信號(hào)通路的“總開(kāi)關(guān)”作用，并通過(guò)乙烯信號(hào)通路調(diào)控植物的耐冷性。SHI等[53]研究發(fā)現(xiàn)，EIN3過(guò)表達(dá)植株的耐冷性減弱，而單突變體ein3-1和雙突變體ein3eil1耐冷性增強(qiáng)，雙突變體CBFs基因表達(dá)顯著上調(diào)；而且EIN3能夠結(jié)合到CBF和ARR5/7/15的啟動(dòng)子上，負(fù)調(diào)控這些基因的表達(dá)。開(kāi)花整合基因SOC1(suppressor of overexpression of CO1)屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，也可以直接結(jié)合CBF啟動(dòng)子的CarG位點(diǎn)抑制CBF及下游系列COR基因表達(dá)，行使其對(duì)植株耐冷性的負(fù)調(diào)控作用[54]。

4.3 其他調(diào)控方式

4.3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族 MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 參與植物的生長(zhǎng)、代謝、抵御生物和非生物脅迫等多種生理生化過(guò)程。R2R3型轉(zhuǎn)錄因子MYB15能識(shí)別并結(jié)合在CBF1/2/3啟動(dòng)子上的MYB位點(diǎn)，抑制CBFs及下游COR基因的表達(dá)，是擬南芥、水稻耐冷性的負(fù)調(diào)控因子[55]。KIM等[56]發(fā)現(xiàn)MYB15的轉(zhuǎn)錄活性受MPK6介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控。MPK6能與MYB15互作，通過(guò)磷酸化MYB15的Ser168位點(diǎn)抑制MYB15蛋白與CBF3啟動(dòng)子的結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)MYB15對(duì)植株響應(yīng)冷脅迫的負(fù)調(diào)控作用。此外，MYB15的轉(zhuǎn)錄活性還受E3泛素連接酶的調(diào)控。PUB25和PUB26是編碼U-box型E3泛素連接酶的兩個(gè)基因，他們都能夠通過(guò)多聚泛素化方式修飾MYB15蛋白，通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解MYB15蛋白，解除MYB15對(duì)CBF基因的抑制作用，進(jìn)而增強(qiáng)冷脅迫下CBF基因表達(dá)。冷誘導(dǎo)的OST1蛋白能夠磷酸化PUB25和PUB26，增強(qiáng)其E3連接酶活性，加速冷誘導(dǎo)MYB15蛋白降解，增強(qiáng)植株的耐冷性[57]。

然而在番茄中，MYB15的表達(dá)可以被HY5(long hypocotyl 5)轉(zhuǎn)錄因子所激活，進(jìn)而促進(jìn)CBF1/2/3的轉(zhuǎn)錄，從而正調(diào)控番茄植株的耐冷性[58]。MYB88/124在蘋(píng)果的抗寒性調(diào)節(jié)中也起正調(diào)控作用，他們不僅能直接正調(diào)控CBFs的轉(zhuǎn)錄，還能通過(guò)不依賴(lài)于CBF的途徑激活冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白MdCSP3(cold shock domain protein 3)的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)控蘋(píng)果的耐寒性[59-60]。

4.3.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 高等生物基因組上大多數(shù)DNA都不編碼蛋白，但也能夠被RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)鏈非編碼RNA，即lncRNA(long non-coding RNA)。大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能目前還不清楚。KINDGREN等[61]在擬南芥基因組的低溫敏感區(qū)域鑒定了一個(gè)名為SVALKA的lncRNA。SVALKA的突變會(huì)影響CBF1基因的表達(dá)和植物的耐冷性。RNAPⅡ通過(guò)轉(zhuǎn)錄SVALKA基因在反義鏈上產(chǎn)生一個(gè)與CBF1基因重疊的lncRNA，即asCBF1。SVALKA-asCBF1 lncRNA級(jí)聯(lián)導(dǎo)致的RNAPII碰撞嚴(yán)格控制著CBF1基因的實(shí)時(shí)表達(dá)，以最小的適應(yīng)性“成本”獲得最大化的耐冷性，有助于植物增強(qiáng)對(duì)于低溫逆境的適應(yīng)性。

5 問(wèn)題與展望

低溫作為全球范圍內(nèi)長(zhǎng)期存在的主要非生物脅迫之一，是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和區(qū)域分布的關(guān)鍵環(huán)境因素。隨著全球氣候的變化，低溫天氣出現(xiàn)的頻次日益增多，已經(jīng)成為制約全球農(nóng)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。因此，培育能夠適應(yīng)未來(lái)低溫氣候的植物新品種，是保障中國(guó)糧食安全、穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵。

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，以分子設(shè)計(jì)育種途徑培育耐冷性植物新品種，已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界的共識(shí)，而其首要條件是獲得具有育種價(jià)值的基因，并明確其生物學(xué)功能。在過(guò)去的20多年里，人們?cè)诙喾N植物中克隆出響應(yīng)冷脅迫的CBF/DREB1基因家族[3-5]，并以擬南芥、水稻、番茄等模式植物為研究對(duì)象，鑒定了一系列CBF信號(hào)通路重要的上游調(diào)控因子，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、E3泛素連接酶等(圖1)，構(gòu)建了較為完善的植物應(yīng)答冷脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6-8]，為培育耐冷性植物新品種積累了基因資源。然而，植物低溫應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)途徑的復(fù)雜過(guò)程，是一個(gè)精細(xì)、嚴(yán)密的調(diào)控系統(tǒng)，這一系統(tǒng)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化歷史中形成的。盡管人們?cè)谥参锢湫盘?hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域取得了不俗的成績(jī)，但我們對(duì)植物低溫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限，這主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：第一，所鑒定的低溫應(yīng)答基因并不能直接用于育種。目前植物低溫應(yīng)答基因大多是采用反向遺傳學(xué)方法獲得，由于物種間遺傳背景的差異，這些基因并不能直接用于育種。例如，異源表達(dá)CBF1/2/3會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育異常，如矮化、器官變小、花期延遲等，而其原因并不清楚[62-63]。而在番茄中，CBF1的過(guò)表達(dá)并不能提高植株耐冷性，甚至導(dǎo)致植株對(duì)低溫敏感[17]。第二，植物感知外界低溫信號(hào)機(jī)制的研究相對(duì)薄弱。目前的研究大多集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面，也就是轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子順式元件的結(jié)合方式，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控只是植物應(yīng)答低溫信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，上游低溫信號(hào)感受器及其誘發(fā)因子(如各種外源物質(zhì))，可能是啟動(dòng)或關(guān)閉轉(zhuǎn)錄調(diào)控的“開(kāi)關(guān)”，但研究報(bào)道較少，目前僅在水稻中發(fā)現(xiàn)了外界低溫感受器COLD1(chilling tolerance divergence 1)[64]。第三，對(duì)冷信號(hào)通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子翻譯后修飾的方式了解不多。從目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看，CBF基因的上游各種調(diào)控因子及其磷酸化、泛素化、SUMO化等少數(shù)幾種翻譯后修飾方式，形成了對(duì)植物應(yīng)答外界低溫的精細(xì)調(diào)控方式的認(rèn)識(shí)，而mRNA前體剪接編輯等轉(zhuǎn)錄后修飾的研究甚少。例如，植物生物鐘組分CCA1能通過(guò)選擇性剪切產(chǎn)生2種異構(gòu)體，均參與對(duì)CBFs基因的調(diào)控[65]。

箭頭為正調(diào)控，T為負(fù)調(diào)控；實(shí)線表示直接作用，虛線表示非直接作用；紅色字體的轉(zhuǎn)錄因子表示源自作物的基因，其他均為擬南芥基因；？代表未知因子。

隨著越來(lái)越多植物基因組測(cè)序的完成，以及各種組學(xué)(基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等)技術(shù)的不斷進(jìn)步，充分利用豐富的植物基因組信息和種質(zhì)資源，借助現(xiàn)代生物科學(xué)和信息學(xué)科技術(shù)方法，未來(lái)可在以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究，實(shí)現(xiàn)植物低溫應(yīng)答機(jī)制的突破性進(jìn)展。1)采用正向遺傳學(xué)方法挖掘耐冷優(yōu)異基因。植物耐冷性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，不同生育期其表型可能不同，首先要建立高通量耐冷性表型全生育期檢測(cè)系統(tǒng)以獲取精準(zhǔn)表型數(shù)據(jù)，利用豐富的種質(zhì)資源和遺傳群體，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、連鎖遺傳定位等方法挖掘控制耐冷性的主效QTL及其關(guān)鍵候選基因，克隆一批能在生產(chǎn)中應(yīng)用的耐冷優(yōu)異基因和基因模塊，積累一批具有育種價(jià)值的基因資源。2)繼續(xù)尋找植物冷信號(hào)通路上游溫度信號(hào)感知因子(特別是膜蛋白基因)，因?yàn)檫@些低溫感受器(蛋白)極有可能發(fā)揮整個(gè)冷信號(hào)通路的“開(kāi)關(guān)”功能；此外，ABA、JA、BRs、Ca2+離子等作為信號(hào)分子參與了植物低溫應(yīng)答調(diào)控[6-8]。這些信號(hào)分子是如何通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相關(guān)基因的表達(dá)，是否參與了低溫感受器的調(diào)控。闡明這些問(wèn)題不僅可以完善植物低溫應(yīng)答信號(hào)通路，還有助于研發(fā)增強(qiáng)植物耐冷性的栽培管理方法(如外源物質(zhì)施用)，為生產(chǎn)服務(wù)。3)進(jìn)一步拓展轉(zhuǎn)錄因子修飾方式的研究。除了常見(jiàn)的磷酸化、泛素化和SUMO化修飾之外，糖基化、脂基化、甲基化、乙?；确g后修飾在決定轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)構(gòu)象及蛋白互作等關(guān)鍵功能方面也有重要作用，mRNA前體剪接加工、編輯、轉(zhuǎn)運(yùn)及microRNA介導(dǎo)的mRNA降解，也是轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄后修飾的重要方式，針對(duì)這些修飾方式的研究，將進(jìn)一步豐富植物應(yīng)答低溫的調(diào)控方式，深化人們對(duì)植物冷信號(hào)調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。