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        在體單向腸灌流法研究胡黃連總苷中4個(gè)成分的大鼠腸吸收特性*

        2022-02-07 03:57:04張琬靖曹寧寧李曉璇裴帥蔡楠肖學(xué)鳳
        天津中醫(yī)藥 2022年12期
        關(guān)鍵詞:腸段總苷夾竹桃

        張琬靖 ,曹寧寧 ,李曉璇 ,裴帥 ,蔡楠 ,肖學(xué)鳳

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617;2.成都先導(dǎo)藥物開發(fā)股份有限公司研發(fā)化學(xué)中心,四川 610200;3.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心,天津 300410)

        胡黃連總苷是從玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariiflora Pennll的干燥根莖,經(jīng)水提、大孔樹脂分離后得到的有效部位。胡黃連總苷主要含胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷等成分[1],是天士力控股集團(tuán)研究院在研的中藥創(chuàng)新藥,于2012年6月取得臨床批件,臨床定位于治療非酒精性脂肪性肝炎。藥理研究表明,胡黃連總苷具有降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫、保肝抗炎等藥理作用[2-4]。目前,胡黃連總苷的腸吸收相關(guān)研究尚未見報(bào)道,故本文對胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠的不同腸段吸收特性進(jìn)行探討,可為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        口服給藥是常用的給藥途徑,腸道為其主要吸收部位,藥物經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液而發(fā)揮藥效作用??疾焖幬镌谀c道中的吸收特性,在一定程度上可反映藥物經(jīng)口服后整體的吸收情況[5-6]。因此,本研究采用大鼠在體單向腸灌流法,運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)同時(shí)測定胡黃連總苷腸灌流液中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷共4個(gè)成分的濃度,以吸收速率常數(shù)(Ka)和有效滲透系數(shù)(Peff)為評價(jià)指標(biāo),考察4個(gè)成分分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收情況,闡明4個(gè)成分的腸吸收特性,旨在為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供參考。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 島津LC-2030C高效液相色譜儀(包括LC-20AD二元泵,CTO-20AC柱溫箱,SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器,UV檢測器,LabSolutions工作站,日本島津公司);EX-H3052百萬分之一電子分析天平(上海贊維衡器有限公司);TG16-WS高速離心機(jī)(湘儀CENCE公司);KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司);恒流蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司);VORTEX 2渦旋混合器(德國IKA公司);FE28 pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q型超純水器(美國Millipore公司)。

        1.2 試劑與試藥 胡黃連總苷粉末由天士力控股集團(tuán)研究院提供(批號:20190101,胡黃連總苷中主要成分胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為38.32%);胡黃連苷Ⅰ對照品(批號:111727-201702,純度95.6%,中國食品藥品檢定研究院);胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11596-201604,純度96.2%,中國食品藥品檢定研究院);胡黃連苷Ⅲ對照品(批號:MUST-20090408,純度99.7%,成都曼斯特生物科技有限公司);草夾竹桃苷對照品(批號:AF20100207,純度98.0%,成都埃法生物科技有限公司);乙腈(色譜級,美國Fisher公司);冰醋酸(色譜級,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,體質(zhì)量 180~200 g,飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件:(22±2)℃,濕度(50±10)%,自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和操作規(guī)程均遵守天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的相關(guān)規(guī)定(倫理審查編號:TCM-LAEC2022193)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 胡黃連總苷制備工藝 稱取適量胡黃連粗粉,加適量純水浸泡,以純水滲漉,收集滲漉液,濃縮至相當(dāng)于1 g/mL原藥材的濃縮液。經(jīng)大孔吸附樹脂,以純水、乙醇洗脫,收集洗脫液、濃縮、冷凍干燥,經(jīng)乙酸乙酯-乙醇回流提取,過濾,濾液濃縮、真空干燥,得胡黃連總苷。

        2.2 Kreb-Ringer’s(K-R)緩沖液的配制 精密稱取氯化鈣0.37 g,氯化鈉7.80 g,氯化鉀0.35 g,碳酸氫鈉1.37 g,磷酸二氫鈉0.32 g,加適量純水使其溶解,再加入氯化鎂0.02 g,葡萄糖1.40 g,充分混勻,加純水定容至1 000 mL,用1 mol/L磷酸調(diào)pH至6.8,即得K-R緩沖液。

        2.3 空白灌流液的制備 取健康SD大鼠6只,實(shí)驗(yàn)前禁食24 h,自由飲水,腹腔注射10%水合氯醛溶液,麻醉后將其固定在手術(shù)臺(tái)上,沿腹腔中線打開腹腔,于十二指腸上部和結(jié)腸下部兩端切口,用預(yù)熱至37℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈后插管,結(jié)扎固定。傷口處用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕,紅外燈照射大鼠腹部保溫。

        用預(yù)熱至37℃的K-R緩沖液以1 mL/min的流速灌流,待腸段內(nèi)充滿K-R緩沖液時(shí),將流速降低至0.2 mL/min,灌流平衡30 min后開始計(jì)時(shí)。進(jìn)口瓶裝有K-R緩沖液,出口瓶用于收集流出灌流液,收集120 min的灌流液,流出灌流液離心半徑10 cm,12 000 r/min 離心 10 min,取上清液,合并,即得空白灌流液。

        2.4 胡黃連總苷灌流液的配制 精密稱取胡黃連總苷粉末0.10 g,置于200 mL容量瓶,用K-R緩沖液溶解并定容,配制成濃度為0.5 mg/mL的胡黃連總苷灌流液。

        2.5 混合對照品溶液的配制 精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷對照品適量,分別用50%乙腈溶解,配制成濃度為1.0 mg/mL的各對照品儲(chǔ)備液。

        精密移取上述對照品儲(chǔ)備液適量,加空白灌流液稀釋,配制成胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷濃度分別為 200、200、50、50 μg/mL的混合對照品溶液。

        2.6 色譜條件 WondaSilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.5%冰醋酸水溶液(15.5∶84.5);流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        2.7 方法學(xué)考察

        2.7.1 專屬性 分別取空白灌流液、混合對照品溶液和胡黃連總苷灌流液適量,按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄其色譜圖,如圖1所示。結(jié)果顯示,空白灌流液對胡黃連總苷中4個(gè)成分的測定無干擾,表明該方法專屬性良好。

        圖1 胡黃連總苷中4個(gè)成分的專屬性Fig.1 Specificity of 4 components of TGPS

        2.7.2 線性關(guān)系、檢測限及定量限 精密移取“2.5”項(xiàng)下混合對照品溶液適量,用空白灌流液稀釋,分別配制成胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ濃度均為200、160、80、40、20、10 μg/mL,胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷濃度均為 50、40、20、10、5、2.5 μg/mL 的對照品溶液。按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以各對照品濃度為橫坐標(biāo)(X),對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外,以信噪比(S/N)為3時(shí)的濃度作為各成分的檢測限,S/N為10時(shí)的濃度為各成分的定量限。胡黃連總苷中4個(gè)成分的線性關(guān)系、檢測限及定量限結(jié)果見表1。

        表1 4個(gè)成分的線性關(guān)系、檢測限及定量限Tab.1 Investigation results of linear relationship of 4 components

        結(jié)果表明,胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.7.3 精密度 精密稱取6份胡黃連總苷粉末,按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液,并按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算胡黃連總苷中4個(gè)成分峰面積RSD,以考察其精密度。結(jié)果顯示,胡黃連總苷中4個(gè)成分峰面積的RSD分別為:胡黃連苷Ⅰ0.87%、胡黃連苷Ⅱ0.52%、胡黃連苷Ⅳ0.92%、草夾竹桃苷0.98%,表明該儀器精密度良好。

        2.7.4 加樣回收率 精密稱取6份胡黃連總苷粉末,每份約0.1 g,精密加入胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷對照品,按“2.4”項(xiàng)下配制方法,配制供試品溶液,并按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率、平均加樣回收率及RSD,結(jié)果見表2。

        表2 4個(gè)成分的加樣回收率Tab.2 Recovery test of 4 components

        結(jié)果顯示,胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷的平均加樣回收率分別為99.82%、99.16%、99.74%、99.51%,加樣回收率RSD均小于0.89%,表明該方法加樣回收率良好。

        2.7.5 穩(wěn)定性 精密稱取胡黃連總苷粉末適量,按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液,置37℃水浴中,分別于第 0、2、4、8、12、24 h 取樣,按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算各成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示,胡黃連總苷中4個(gè)成分的峰面積RSD分別為:胡黃連苷Ⅰ0.89%、胡黃連苷Ⅱ0.74%、胡黃連苷Ⅳ0.90%、草夾竹桃苷0.83%,表明各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7.6 耐用性 精密稱取胡黃連總苷粉末適量,按“2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液。在“2.6”色譜條件基礎(chǔ)上,改變色譜柱、柱溫、流速及流動(dòng)相比例,測定供試品溶液中各成分含量,并計(jì)算RSD,以考察該方法的耐用性。結(jié)果見表3。

        表3 4個(gè)成分的耐用性Tab.3 Durability test of 4 components

        結(jié)果顯示,胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷含量RSD均小于0.93%,表明測定條件小的變動(dòng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求,該方法具有較好的耐用性。

        2.8 大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)

        2.8.1 在體單向腸灌流法 為保證大鼠腸道良好的吸收狀態(tài),每只大鼠僅使用單一腸段進(jìn)行單次試驗(yàn)。取健康SD大鼠24只,隨機(jī)分為4組,分別為十二指腸組、空腸組、回腸組和結(jié)腸組,每組6只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h,自由飲水,腹腔注射10%水合氯醛溶液,麻醉后將其固定在手術(shù)臺(tái)上,沿腹腔中線打開腹腔,選取需要考察的腸段約10 cm(不同腸段區(qū)間:十二指腸為距幽門1 cm處開始,空腸為距幽門15 cm處開始,回腸為距盲腸上行20 cm處開始,結(jié)腸為距盲腸后端開始)。于所選腸段兩端切口,用預(yù)熱至37℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈后插管,結(jié)扎固定。傷口處用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕,紅外燈照射大鼠腹部保溫。

        用預(yù)熱至37℃的胡黃連總苷灌流液以1mL/min的流速灌流,待腸段內(nèi)充滿胡黃連總苷灌流液時(shí),將流速降低至0.2 mL/min,灌流平衡30 min后開始計(jì)時(shí)。進(jìn)口瓶裝有胡黃連總苷灌流液,為流入灌流液;出口瓶用于收集流出灌流液,進(jìn)口瓶和出口瓶均提前稱重,每隔15 min更換進(jìn)口瓶和出口瓶,同時(shí)記錄進(jìn)口瓶和出口瓶的質(zhì)量,共收集8個(gè)時(shí)間段的流出灌流液,實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)長120 min,流出灌流液離心半徑10 cm,12 000 r/min離心10 min,取上清液,用0.45 μm 微孔濾膜過濾,按“2.6”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠,剪下所考察腸段,測量不同腸段長度(L)和周長,由3次周長測量值求得平均半徑(R)。

        2.8.2 腸吸收參數(shù)計(jì)算 采用重量法對流入灌流液和流出灌流液體積和密度進(jìn)行校正,消除灌流液體積和密度變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響[7]。精密吸取1.0 mL流入灌流液,置于已知質(zhì)量的玻璃瓶中,稱量液體質(zhì)量,計(jì)算流入灌流液密度ρin;精密吸取1.0 mL流出灌流液,置于已知質(zhì)量的玻璃瓶中,稱量液體質(zhì)量,計(jì)算流出灌流液密度ρout。按下列公式計(jì)算腸吸收參數(shù)吸收速率常數(shù)(Ka)和有效滲透系數(shù)(Peff),以此分析胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的腸吸收特性。

        其中Vin、Vout分別為流入灌流液體積、流出灌流液體積(mL);Min、Mout分別為流入灌流液質(zhì)量、流出灌流液質(zhì)量(g);Cin、Cout分別為流入灌流液中各成分濃度、流出灌流液中各成分濃度(μg/mL);R、L為被考察腸段的半徑、長度(cm);Q為灌流速度(0.2 mL/min)。

        2.8.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2.8.4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收特性 取濃度為0.5 mg/mL的胡黃連總苷灌流液,采用在體單向腸灌流法進(jìn)行灌流,以腸吸收參數(shù)Ka和Peff為評價(jià)指標(biāo),考察胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ、草夾竹桃苷共4個(gè)成分分別在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收特性。其中Ka代表成分從吸收部位進(jìn)入體循環(huán)的速度,反映成分在不同腸段中的吸收快慢,Ka越大,表明成分在該腸段中的吸收越快;Peff代表成分透過生物膜的滲透能力,反映成分在不同腸段中的吸收能力的強(qiáng)弱[8]。一般當(dāng)Peff>2.0×10-5cm/min 時(shí),表明成分在該腸段中吸收良好[9]。胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)見表4和表5,4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)見圖2。

        圖2 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)比較Fig.2 Compare with Kaand Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments

        表4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)(±s,n=6)Tab.4 Kaof 4 components of TGPS in different intestinal segments(±s,n=6)

        表4 胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速率常數(shù)(±s,n=6)Tab.4 Kaof 4 components of TGPS in different intestinal segments(±s,n=6)

        注:與十二指腸比較,*P<0.05;與空腸比較,#P<0.05;與回腸比較,△P<0.05。

        成分Ka(×10-2/min)十二指腸 空腸 回腸 結(jié)腸胡黃連苷Ⅰ 1.91±0.11 1.97±0.33 1.79±0.16 1.98±0.13胡黃連苷Ⅱ 2.24±0.16 1.76±0.26* 1.84±0.38* 1.65±0.21*△胡黃連苷Ⅳ 2.10±0.26 2.41±0.14* 2.17±0.15# 1.73±0.17*#△草夾竹桃苷 2.28±0.16 2.72±0.21* 3.83±0.31*#4.97±0.36*#△

        表5 胡黃連總苷4個(gè)成分在不同腸段的有效滲透系數(shù)(±s,n=6)Tab.5 Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments(±s,n=6)

        表5 胡黃連總苷4個(gè)成分在不同腸段的有效滲透系數(shù)(±s,n=6)Tab.5 Peffof 4 components of TGPS in different intestinal segments(±s,n=6)

        注:與十二指腸比較,*P<0.05;與空腸比較,#P<0.05;與回腸比較,△P<0.05。

        成分Peff(×10-3cm/min)十二指腸 空腸 回腸 結(jié)腸胡黃連苷Ⅰ 2.04±0.11 2.11±0.13 1.99±0.20 2.19±0.17△胡黃連苷Ⅱ 2.46±0.22 1.83±0.17* 2.22±0.25*#1.79±0.18*△胡黃連苷Ⅳ 2.27±0.22 2.65±0.28* 2.29±0.26# 2.12±0.14#草夾竹桃苷 2.47±0.31 2.91±0.24* 5.05±0.43*#6.23±0.27*#△

        由表可知,胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段均 Ka>1.65×10-2/min,Peff>2.0×10-5cm/min,表明各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好,即各成分在不同腸段均易吸收,但各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異。通過比較不同腸段的Ka、Peff值,結(jié)果顯示:1)胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅰ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋航Y(jié)腸>空腸>十二指腸>回腸,其中,除結(jié)腸與回腸的Peff值有顯著性差異(P<0.05),其余參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05),因此,胡黃連苷Ⅰ無主要吸收部位。2)胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅱ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋菏改c>回腸>空腸>結(jié)腸,其中,十二指腸和回腸、結(jié)腸、空腸的Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此,十二指腸為胡黃連苷Ⅱ的主要吸收部位。3)胡黃連總苷中胡黃連苷Ⅳ在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋嚎漳c>回腸>十二指腸>結(jié)腸,其中,空腸和回腸、十二指腸、結(jié)腸的Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此,空腸為胡黃連苷Ⅳ的主要吸收部位。4)胡黃連總苷中草夾竹桃苷在不同腸段的Ka、Peff值大小順序?yàn)椋航Y(jié)腸>回腸>空腸>十二指腸,其中,結(jié)腸和回腸、空腸、十二指腸的 Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此,結(jié)腸為草夾竹桃苷的主要吸收部位。

        比較胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的Ka、Peff值,結(jié)果顯示,各成分的 Ka、Peff值大小順序?yàn)椋涸谑改c中,草夾竹桃苷>胡黃連苷Ⅱ>胡黃連苷Ⅳ>胡黃連苷Ⅰ;在空腸中,草夾竹桃苷>胡黃連苷Ⅳ>胡黃連苷Ⅰ>胡黃連苷Ⅱ;在回腸中,草夾竹桃苷>胡黃連苷Ⅳ>胡黃連苷Ⅱ>胡黃連苷Ⅰ;在結(jié)腸中,草夾竹桃苷>胡黃連苷Ⅰ>胡黃連苷Ⅳ>胡黃連苷Ⅱ。值得注意的是,在不同腸段中,草夾竹桃苷與其他3個(gè)成分比較,Ka、Peff值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且其在不同腸段的吸收均最佳。

        3 討論

        3.1 腸吸收研究方法的選擇 影響口服藥物的藥效因素眾多,除藥物的化學(xué)成分復(fù)雜外,其在體內(nèi)的吸收過程也是重要影響因素[10]。腸吸收作為口服藥物的主要吸收途徑,目前對其的研究方法主要有3種,分別為體外法、體內(nèi)法和在體法[11]。體外法主要有2種研究方法,分別為外翻腸囊法和Caco-2細(xì)胞模型法,其操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短,可用于藥物早期高通量篩選,但體外環(huán)境無法保證血液的正常供應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)的完整性,生物活性較差,不能反映藥物在腸道環(huán)境中的真實(shí)吸收情況[12-13];體內(nèi)法主要研究方法為血藥濃度法,采用整體動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),能真實(shí)地反映藥物經(jīng)口服后在體內(nèi)的吸收情況,但實(shí)驗(yàn)周期較長,影響因素較多,無法特異性地反映藥物在腸道的吸收特性[14];在體法主要研究方法為循環(huán)腸灌流法和單向腸灌流法,前者灌流時(shí)間長、流速快,易損傷腸黏膜,而單向腸灌流法由于具有灌流時(shí)間短、流速低等特點(diǎn),對腸黏膜的影響較小,可模擬真實(shí)的腸道環(huán)境,且此方法已被美國FDA認(rèn)可,應(yīng)用廣泛[15-16],因此,本課題采用在體單向腸灌流法研究胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性,整體反映藥物在腸道的吸收情況。

        3.2 灌流液體積校正方法的選擇 在體單向腸灌流過程中,腸道不僅吸收藥物,同時(shí)也會(huì)吸收或分泌水分,導(dǎo)致直接測得的藥物濃度與實(shí)際藥物濃度之間有偏差。此外,由于在腸灌流過程中,可能會(huì)引起腸壁細(xì)胞溶蝕破裂、腸黏膜脫落等現(xiàn)象,進(jìn)而導(dǎo)致流出灌流液密度發(fā)生變化,故需通過校正流出灌流液的體積和密度,以校正藥物濃度,保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[17]。灌流液體積和密度的校正方法主要有2種,分別為標(biāo)示物法和重量法[18]。標(biāo)示物法是指在灌流液中加入不易被腸道吸收的物質(zhì)作為標(biāo)示物,以標(biāo)示物為參照量對藥物濃度進(jìn)行校正,常用的標(biāo)示物為酚紅和14C-PEG[19],但研究顯示,腸道對酚紅存在一定程度的吸收,且酚紅可能干擾某些成分的轉(zhuǎn)運(yùn)和分析測定,不適于對所有成分的腸吸收研究[20];14C-PEG具有放射性,安全性和檢測方法的復(fù)雜性制約其在普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[21]。重量法通過計(jì)算流入和流出腸道的灌流液質(zhì)量比對藥物濃度進(jìn)行校正,可節(jié)省檢測標(biāo)示物濃度的過程,操作相對簡單,同時(shí)可真實(shí)地反映藥物在腸道的吸收情況[22]。因此,本課題采用重量法對灌流液體積和密度進(jìn)行校正,消除灌流液體積和密度的變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

        3.3 胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性 本研究以Ka和Peff為評價(jià)指標(biāo),考察胡黃連總苷中4個(gè)成分分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收情況,以闡明胡黃連總苷中4個(gè)成分的腸吸收特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好,即4個(gè)成分在不同腸段均易吸收。但在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異,推測可能與各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),胡黃連總苷中4個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

        圖3 胡黃連總苷中4個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of 4 components of TGPS

        胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷1、胡黃連苷3均為環(huán)烯醚萜苷類成分,其中,胡黃連苷I為肉桂酸與糖酯化生成的一種環(huán)烯醚萜苷,其苯環(huán)上無酚羥基等酸性基團(tuán)和甲氧基等供電子基團(tuán),故胡黃連苷Ⅰ顯中性,推測此可能為胡黃連苷Ⅰ無主要吸收部位的原因。胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅳ均在胡黃連苷Ⅰ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入酚羥基,酚羥基顯酸性,但由于其它基團(tuán)的存在導(dǎo)致各成分的酸性程度有所差異。其中,胡黃連苷Ⅱ酸性最強(qiáng),主要吸收部位在十二指腸;胡黃連苷Ⅱ中酚羥基對位為碳氧雙鍵,而胡黃連苷Ⅳ中酚羥基對位為碳碳雙鍵,碳碳雙鍵的吸電子能力弱于碳氧雙鍵,導(dǎo)致胡黃連苷Ⅳ酸性減弱,其吸收部位向后移動(dòng),故胡黃連苷Ⅳ主要吸收部位在空腸;草夾竹桃苷為苯乙酮苷類成分,苯乙酮母核呈中性,但由于其酚羥基鄰位為甲氧基,甲氧基作為供電子基團(tuán)可減弱草夾竹桃苷的酸性[23],導(dǎo)致其吸收部位后移,主要在結(jié)腸被吸收。此外,與胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ相比,草夾竹桃苷在不同腸段中吸收最好,可能與其分子量較小,較易透過生物膜有關(guān)。因此,初步推斷,胡黃連總苷中4個(gè)成分在不同腸段的吸收程度不同與各成分中酚羥基、碳碳雙鍵、甲氧基等基團(tuán)位置和分子量大小有關(guān)。

        綜上,本研究考察了胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收特性,結(jié)果表明,胡黃連總苷中4個(gè)成分在大鼠不同腸段的吸收速度和吸收能力均良好,但各成分在不同腸段的吸收速度和吸收能力存在一定差異。其中,胡黃連苷Ⅰ無主要吸收部位;胡黃連苷Ⅱ、胡黃連苷Ⅳ和草夾竹桃苷的主要吸收部位分別為十二指腸、空腸和結(jié)腸;草夾竹桃苷與其他3個(gè)成分比較,在不同腸段中吸收均最佳,為胡黃連總苷的臨床合理用藥提供明確參考。

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