李浩龍， 周 蓉， 蔣芳玲， 文軍琴， 劉 帥， 吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，江蘇南京210095)

普通栽培番茄大多屬于中度鹽敏感作物，為番茄耐鹽品種選育所提供的材料十分有限。但野生番茄資源含有許多潛在的耐鹽基因，可以為番茄耐鹽品種的選育提供優(yōu)異變異來源[1-2]。目前，研究者在潘那利番茄(Solanumpennellii)等野生番茄資源中均已鑒定出豐富的耐鹽片段[3-7]。近幾十年來，野生番茄資源中的耐鹽基因被育種學家廣泛應(yīng)用于栽培番茄的遺傳改良研究中[8-11]。野生番茄中醋栗番茄與栽培番茄的親緣關(guān)系最近，醋栗番茄內(nèi)的耐鹽基因通過雜交的手段更易轉(zhuǎn)移到栽培番茄中。漸滲系(Introgression line，IL)群體是通過兩親本不斷回交和自交構(gòu)建而成的，群體內(nèi)各株系基因組與受體親本大致相同，僅有一小部分被供體親本基因組所代替。通過構(gòu)建醋栗番茄IL群體并篩選耐鹽株系，對挖掘醋栗番茄中優(yōu)異耐鹽基因具有重要意義。

隨著番茄的生長發(fā)育，對鹽脅迫的敏感程度逐漸降低，苗期是對鹽脅迫最敏感的時期之一[12]。番茄的耐鹽性屬于多基因控制的性狀，單指標難以準確地反映番茄的耐鹽性。近年來，基于多指標對植物耐鹽性進行綜合評價的方法已在各種作物中廣泛應(yīng)用[13-16]。前人在研究中發(fā)現(xiàn)，醋栗番茄(Solanumpimpinellifoliumn)LA2093對鹽脅迫不敏感，屬于耐鹽番茄種植資源[17]。因此，本研究以耐鹽醋栗番茄LA2093漸滲系(IL)BC3F3代群體(共19個漸滲系株系)及親本為試驗材料，在幼苗期對各番茄材料的耐鹽相關(guān)指標進行測定并計算耐鹽性系數(shù)，然后利用多元分析方法綜合評價番茄各株系耐鹽性，篩選出耐鹽株系，并獲得有效評價番茄苗期耐鹽性的重要指標。本研究結(jié)果可為耐鹽番茄品種的鑒定和選育提供理論參考，也可為后續(xù)醋栗番茄中耐鹽關(guān)鍵基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以19個醋栗番茄單片段漸滲系株系及漸滲系群體親本為試驗材料(表1)。19個單片段漸滲系株系從南京農(nóng)業(yè)大學蔬菜生理生態(tài)實驗室通過3代回交和2代自交構(gòu)建的BC3F3代漸滲系群體中選出，以栽培番茄(Solanumlycopersicum) Jina 為母本，醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)LA2093 為父本，其滲入片段覆蓋野生番茄全基因組的65%左右。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020年10月至11月在南京農(nóng)業(yè)大學玻璃溫室中進行，播種所用基質(zhì)各成分含量比例為2∶1∶1(草炭∶蛭石∶珍珠巖)。待番茄幼苗長至2葉1心期時，將長勢相同的番茄幼苗移栽到32孔穴盤中，采用1/2日本園式營養(yǎng)液培養(yǎng)。待幼苗長至5葉1心時，以添加含有200 mmol/L NaCl的1/2日本園式營養(yǎng)液為處理組，以添加不含NaCl的1/2日本園式營養(yǎng)液為對照組。試驗期間營養(yǎng)液每2 d更換1次，每次添加5 L，添加前倒出穴盤中所有溶液，以保持滲透勢穩(wěn)定。每個處理15株，每3株為1個重復(fù)，共5個重復(fù)，數(shù)據(jù)取5個重復(fù)的平均值。

表1 供試植株材料編號及滲入片段所在染色體編號

1.3 耐鹽鑒定指標及測定方法

1.3.1 生長指標 在鹽處理第10 d，測量番茄幼苗的株高和莖粗。取出幼苗并用去離子水沖洗干凈，吸干表面水分，稱其鮮質(zhì)量；然后將幼苗裝入信封中，在烘箱中先殺青10 min(105 ℃)，然后烘48 h(80 ℃)至恒質(zhì)量取出，稱其干質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素相對含量 在鹽處理第6 d，取自頂部向下數(shù)第3張完全展開的葉片，利用葉綠素儀(SPAD-502 Plus，日本)檢測葉綠素相對含量。

1.3.3 丙二醛和過氧化氫含量 在鹽處理第6 d，取自頂部向下數(shù)第3張完全展開的葉片，丙二醛(MDA)含量和過氧化氫(H2O2)含量的測定方法參照李合生[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與計算

用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行多元分析(相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析和逐步回歸分析)。試驗所用的計算公式如下：

單項指標耐鹽性系數(shù)(α)：

(1)

7個指標中基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)越高代表越不耐鹽，其余指標的耐鹽性系數(shù)越高代表越耐鹽。因此，在對各指標耐鹽性系數(shù)進行多元分析時，將基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)轉(zhuǎn)化為倒數(shù)參與統(tǒng)計。

各綜合指標隸屬函數(shù)值：

(2)

式中，Xi表示第i個綜合指標;Xmin表示第i個綜合指標的最小值;Xmax表示第i個綜合指標的最大值。綜合指標由單項指標通過主成分分析提取得到。

各綜合指標權(quán)重：

(3)

式中，Wi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度(權(quán)重);Pi表示第i個綜合指標的貢獻率。

耐鹽性綜合評價值(D)：

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 21份番茄材料基于各指標的耐鹽性系數(shù)及其相關(guān)性分析

由表2可知，供試材料基于株高的耐鹽性系數(shù)(α1)、基于莖粗的耐鹽性系數(shù)(α2)、基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α3)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α4)和基于葉綠素相對含量的耐鹽性系數(shù)(α5)與對照相比整體均有所下降(α<1)，而基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)和基于過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)與之相反，均有所增加(α>1)。1號(母本)和2號(父本)相比，2號番茄除基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)、基于過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)低于母本以外，基于其余各指標的耐鹽性系數(shù)均高于母本，且與其他19份漸滲系株系相比耐鹽性系數(shù)較高，說明受鹽脅迫影響較小，父本番茄中含有耐鹽優(yōu)異基因。此外還發(fā)現(xiàn)，19份漸滲系株系的各個指標對鹽脅迫響應(yīng)程度并不相同，僅用單個指標難以直接確定各株系的耐鹽性。

表2 21份番茄材料基于各單項指標的耐鹽性系數(shù)

由相關(guān)性分析結(jié)果(表3)可知，基于植株株高的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間，基于莖粗的耐鹽性系數(shù)和基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對含量的耐鹽性系數(shù)之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01)；基于株高的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對含量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對含量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間存在顯著相關(guān)(P<0.05)，其他指標間也存在或多或少的相關(guān)性。由上述相關(guān)性分析結(jié)果可知，利用不同指標表征番茄耐鹽性時，各指標所代表的信息之間存在重疊，同時各指標所代表的番茄耐鹽性程度也不一樣，可能導(dǎo)致最終的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此，需要對測定指標進行降維處理，構(gòu)建綜合評價指標，才能更有效地評價番茄苗期耐鹽性。

表3 21份番茄材料基于各單項指標耐鹽性系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣

2.2 不同指標耐鹽性系數(shù)的主成分分析及權(quán)重計算

表4 21份番茄材料苗期耐鹽指標主成分分析及權(quán)重

2.3 各番茄材料耐鹽性評價

利用公式(2)計算各綜合指標的隸屬函數(shù)值，利用公式(3)計算各綜合指標的權(quán)重，利用公式(4)計算獲得各番茄材料的耐鹽性綜合評價值(D)(表5)。通過比較發(fā)現(xiàn)，2號父本D值最大，為0.810，耐鹽性最強；1號母本D值為0.340，耐鹽性較弱。19份漸滲系株系的D值范圍為0.161～0.762，其中IL-6號番茄D值最大，耐鹽性最強；IL-18號番茄D值最小，耐鹽性最弱。如圖1所示，對各番茄材料D值進行聚類分析，將父本、母本及19份漸滲系株系分成2類，耐鹽類(Ⅰ)：2、IL-6、IL-9和IL-12；不耐鹽類(Ⅱ)：1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。

2.4 耐鹽指標的篩選和番茄苗期耐鹽性預(yù)測

表5 21份番茄材料幼苗植株的綜合指標、隸屬函數(shù)值、綜合評價值和預(yù)測值

圖1 不同番茄材料D值聚類分析結(jié)果Fig.1 D-value cluster analysis of different tomato materials

3 討論

3.1 番茄苗期耐鹽性綜合評價及指標的篩選

本研究中，鹽脅迫下各番茄材料的株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量和葉綠素相對含量的耐鹽性系數(shù)與對照相比整體表現(xiàn)為降低趨勢，而丙二醛和過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)與對照相比均升高，且不同材料間各指標對應(yīng)的耐鹽性系數(shù)變化程度不同。對株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、葉綠素相對含量、丙二醛含量和過氧化氫含量7項指標對應(yīng)的耐鹽性系數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果表明，各指標所代表的信息之間存在交叉重疊。因此，僅憑借單個指標無法全面反映番茄的耐鹽性，需要提取綜合指標來評價其耐鹽性。耐鹽性系數(shù)可以更加準確地反映植物的耐鹽能力，目前，已有大量研究以耐鹽性系數(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合多元分析方法綜合評價植株耐鹽性[19-24]。本研究以番茄苗期7個指標的耐鹽性系數(shù)或耐鹽性系數(shù)的倒數(shù)為基礎(chǔ)，提取了4個獨立的綜合指標，通過對4個綜合指標進行隸屬函數(shù)分析并求出各番茄材料的耐鹽性綜合評價值。由于耐鹽性綜合評價值是0～1的純數(shù)[25]，故可以更加科學、直觀地比較各番茄材料的耐鹽性。通過對D值聚類分析，較為客觀地將19份漸滲系株系分成耐鹽類和不耐鹽類，其中不耐鹽類漸滲系株系有16份，耐鹽類漸滲系株系有3份。

3.2 耐鹽株系的利用

本研究通過對醋栗番茄漸滲系株系進行耐鹽性評價，初步篩選出3個耐鹽漸滲系株系，分別為IL-6、IL-9和IL-12，其中IL-6耐鹽性最強。3個耐鹽株系的染色體一小部分被父本醋栗番茄所替代，而其余染色體與母本栽培番茄Jina相同。其中L-9和IL-12株系均含有醋栗番茄第6號染色體部分片段，IL-6含有醋栗番茄第11號染色體部分片段。本研究結(jié)果表明，母本為不耐鹽番茄，而父本為耐鹽番茄，耐鹽株系的耐鹽性與其所攜帶的父本染色體滲入片段有關(guān)。后期可通過耐鹽株系與輪回母本Jina進一步雜交并自交多代，構(gòu)建各自耐鹽系亞系群體。利用已公布的醋栗番茄LA2093基因組數(shù)據(jù)[30]，進一步開發(fā)分子標記對耐鹽亞系群體進行基因分型并結(jié)合耐鹽性鑒定，挖掘耐鹽關(guān)鍵基因。利用耐鹽漸滲系株系挖掘耐鹽基因已有相關(guān)報道，例如余慶輝等[9]利用耐鹽漸滲系株系IL7-5，通過加密分子標記構(gòu)建該片段遺傳連鎖圖譜并進行耐鹽鑒定，實現(xiàn)了Stq7b耐鹽的主效位點精細定位，并篩選出2個耐鹽候選基因；周龍溪[8]同樣以耐鹽漸滲系IL7-5與M82為親本構(gòu)建了IL7-5 Sub-ILs漸滲系亞系群體，通過對亞系群體進行耐鹽性鑒定，最終發(fā)現(xiàn)苗期耐鹽主效QTLStq7位點和6個耐鹽候選基因。

4 結(jié)論