李浩龍， 周 蓉， 蔣芳玲， 文軍琴， 劉 帥， 吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

普通栽培番茄大多屬于中度鹽敏感作物，為番茄耐鹽品種選育所提供的材料十分有限。但野生番茄資源含有許多潛在的耐鹽基因，可以為番茄耐鹽品種的選育提供優(yōu)異變異來源[1-2]。目前，研究者在潘那利番茄(Solanumpennellii)等野生番茄資源中均已鑒定出豐富的耐鹽片段[3-7]。近幾十年來，野生番茄資源中的耐鹽基因被育種學(xué)家廣泛應(yīng)用于栽培番茄的遺傳改良研究中[8-11]。野生番茄中醋栗番茄與栽培番茄的親緣關(guān)系最近，醋栗番茄內(nèi)的耐鹽基因通過雜交的手段更易轉(zhuǎn)移到栽培番茄中。漸滲系(Introgression line，IL)群體是通過兩親本不斷回交和自交構(gòu)建而成的，群體內(nèi)各株系基因組與受體親本大致相同，僅有一小部分被供體親本基因組所代替。通過構(gòu)建醋栗番茄IL群體并篩選耐鹽株系，對(duì)挖掘醋栗番茄中優(yōu)異耐鹽基因具有重要意義。

隨著番茄的生長發(fā)育，對(duì)鹽脅迫的敏感程度逐漸降低，苗期是對(duì)鹽脅迫最敏感的時(shí)期之一[12]。番茄的耐鹽性屬于多基因控制的性狀，單指標(biāo)難以準(zhǔn)確地反映番茄的耐鹽性。近年來，基于多指標(biāo)對(duì)植物耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法已在各種作物中廣泛應(yīng)用[13-16]。前人在研究中發(fā)現(xiàn)，醋栗番茄(Solanumpimpinellifoliumn)LA2093對(duì)鹽脅迫不敏感，屬于耐鹽番茄種植資源[17]。因此，本研究以耐鹽醋栗番茄LA2093漸滲系(IL)BC3F3代群體(共19個(gè)漸滲系株系)及親本為試驗(yàn)材料，在幼苗期對(duì)各番茄材料的耐鹽相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定并計(jì)算耐鹽性系數(shù)，然后利用多元分析方法綜合評(píng)價(jià)番茄各株系耐鹽性，篩選出耐鹽株系，并獲得有效評(píng)價(jià)番茄苗期耐鹽性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果可為耐鹽番茄品種的鑒定和選育提供理論參考，也可為后續(xù)醋栗番茄中耐鹽關(guān)鍵基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以19個(gè)醋栗番茄單片段漸滲系株系及漸滲系群體親本為試驗(yàn)材料(表1)。19個(gè)單片段漸滲系株系從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室通過3代回交和2代自交構(gòu)建的BC3F3代漸滲系群體中選出，以栽培番茄(Solanumlycopersicum) Jina 為母本，醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)LA2093 為父本，其滲入片段覆蓋野生番茄全基因組的65%左右。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年10月至11月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室中進(jìn)行，播種所用基質(zhì)各成分含量比例為2∶1∶1(草炭∶蛭石∶珍珠巖)。待番茄幼苗長至2葉1心期時(shí)，將長勢相同的番茄幼苗移栽到32孔穴盤中，采用1/2日本園式營養(yǎng)液培養(yǎng)。待幼苗長至5葉1心時(shí)，以添加含有200 mmol/L NaCl的1/2日本園式營養(yǎng)液為處理組，以添加不含NaCl的1/2日本園式營養(yǎng)液為對(duì)照組。試驗(yàn)期間營養(yǎng)液每2 d更換1次，每次添加5 L，添加前倒出穴盤中所有溶液，以保持滲透勢穩(wěn)定。每個(gè)處理15株，每3株為1個(gè)重復(fù)，共5個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)取5個(gè)重復(fù)的平均值。

表1 供試植株材料編號(hào)及滲入片段所在染色體編號(hào)

1.3 耐鹽鑒定指標(biāo)及測定方法

1.3.1 生長指標(biāo) 在鹽處理第10 d，測量番茄幼苗的株高和莖粗。取出幼苗并用去離子水沖洗干凈，吸干表面水分，稱其鮮質(zhì)量；然后將幼苗裝入信封中，在烘箱中先殺青10 min(105 ℃)，然后烘48 h(80 ℃)至恒質(zhì)量取出，稱其干質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素相對(duì)含量 在鹽處理第6 d，取自頂部向下數(shù)第3張完全展開的葉片，利用葉綠素儀(SPAD-502 Plus，日本)檢測葉綠素相對(duì)含量。

1.3.3 丙二醛和過氧化氫含量 在鹽處理第6 d，取自頂部向下數(shù)第3張完全展開的葉片，丙二醛(MDA)含量和過氧化氫(H2O2)含量的測定方法參照李合生[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算

用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元分析(相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析和逐步回歸分析)。試驗(yàn)所用的計(jì)算公式如下：

單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽性系數(shù)(α)：

(1)

7個(gè)指標(biāo)中基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)越高代表越不耐鹽，其余指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)越高代表越耐鹽。因此，在對(duì)各指標(biāo)耐鹽性系數(shù)進(jìn)行多元分析時(shí)，將基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)轉(zhuǎn)化為倒數(shù)參與統(tǒng)計(jì)。

各綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值：

(2)

式中，Xi表示第i個(gè)綜合指標(biāo);Xmin表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最小值;Xmax表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。綜合指標(biāo)由單項(xiàng)指標(biāo)通過主成分分析提取得到。

各綜合指標(biāo)權(quán)重：

(3)

式中，Wi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度(權(quán)重);Pi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值(D)：

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 21份番茄材料基于各指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)及其相關(guān)性分析

由表2可知，供試材料基于株高的耐鹽性系數(shù)(α1)、基于莖粗的耐鹽性系數(shù)(α2)、基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α3)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α4)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)(α5)與對(duì)照相比整體均有所下降(α<1)，而基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)和基于過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)與之相反，均有所增加(α>1)。1號(hào)(母本)和2號(hào)(父本)相比，2號(hào)番茄除基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)、基于過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)低于母本以外，基于其余各指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)均高于母本，且與其他19份漸滲系株系相比耐鹽性系數(shù)較高，說明受鹽脅迫影響較小，父本番茄中含有耐鹽優(yōu)異基因。此外還發(fā)現(xiàn)，19份漸滲系株系的各個(gè)指標(biāo)對(duì)鹽脅迫響應(yīng)程度并不相同，僅用單個(gè)指標(biāo)難以直接確定各株系的耐鹽性。

表2 21份番茄材料基于各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)

由相關(guān)性分析結(jié)果(表3)可知，基于植株株高的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間，基于莖粗的耐鹽性系數(shù)和基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01)；基于株高的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)之間，基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間存在顯著相關(guān)(P<0.05)，其他指標(biāo)間也存在或多或少的相關(guān)性。由上述相關(guān)性分析結(jié)果可知，利用不同指標(biāo)表征番茄耐鹽性時(shí)，各指標(biāo)所代表的信息之間存在重疊，同時(shí)各指標(biāo)所代表的番茄耐鹽性程度也不一樣，可能導(dǎo)致最終的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此，需要對(duì)測定指標(biāo)進(jìn)行降維處理，構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，才能更有效地評(píng)價(jià)番茄苗期耐鹽性。

表3 21份番茄材料基于各單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽性系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣

2.2 不同指標(biāo)耐鹽性系數(shù)的主成分分析及權(quán)重計(jì)算

表4 21份番茄材料苗期耐鹽指標(biāo)主成分分析及權(quán)重

2.3 各番茄材料耐鹽性評(píng)價(jià)

利用公式(2)計(jì)算各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，利用公式(3)計(jì)算各綜合指標(biāo)的權(quán)重，利用公式(4)計(jì)算獲得各番茄材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值(D)(表5)。通過比較發(fā)現(xiàn)，2號(hào)父本D值最大，為0.810，耐鹽性最強(qiáng)；1號(hào)母本D值為0.340，耐鹽性較弱。19份漸滲系株系的D值范圍為0.161～0.762，其中IL-6號(hào)番茄D值最大，耐鹽性最強(qiáng)；IL-18號(hào)番茄D值最小，耐鹽性最弱。如圖1所示，對(duì)各番茄材料D值進(jìn)行聚類分析，將父本、母本及19份漸滲系株系分成2類，耐鹽類(Ⅰ)：2、IL-6、IL-9和IL-12；不耐鹽類(Ⅱ)：1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。

2.4 耐鹽指標(biāo)的篩選和番茄苗期耐鹽性預(yù)測

表5 21份番茄材料幼苗植株的綜合指標(biāo)、隸屬函數(shù)值、綜合評(píng)價(jià)值和預(yù)測值

圖1 不同番茄材料D值聚類分析結(jié)果Fig.1 D-value cluster analysis of different tomato materials

3 討論

3.1 番茄苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)及指標(biāo)的篩選

本研究中，鹽脅迫下各番茄材料的株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量和葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)與對(duì)照相比整體表現(xiàn)為降低趨勢，而丙二醛和過氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)與對(duì)照相比均升高，且不同材料間各指標(biāo)對(duì)應(yīng)的耐鹽性系數(shù)變化程度不同。對(duì)株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、葉綠素相對(duì)含量、丙二醛含量和過氧化氫含量7項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的耐鹽性系數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果表明，各指標(biāo)所代表的信息之間存在交叉重疊。因此，僅憑借單個(gè)指標(biāo)無法全面反映番茄的耐鹽性，需要提取綜合指標(biāo)來評(píng)價(jià)其耐鹽性。耐鹽性系數(shù)可以更加準(zhǔn)確地反映植物的耐鹽能力，目前，已有大量研究以耐鹽性系數(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合多元分析方法綜合評(píng)價(jià)植株耐鹽性[19-24]。本研究以番茄苗期7個(gè)指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)或耐鹽性系數(shù)的倒數(shù)為基礎(chǔ)，提取了4個(gè)獨(dú)立的綜合指標(biāo)，通過對(duì)4個(gè)綜合指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析并求出各番茄材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值。由于耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值是0～1的純數(shù)[25]，故可以更加科學(xué)、直觀地比較各番茄材料的耐鹽性。通過對(duì)D值聚類分析，較為客觀地將19份漸滲系株系分成耐鹽類和不耐鹽類，其中不耐鹽類漸滲系株系有16份，耐鹽類漸滲系株系有3份。

3.2 耐鹽株系的利用

本研究通過對(duì)醋栗番茄漸滲系株系進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，初步篩選出3個(gè)耐鹽漸滲系株系，分別為IL-6、IL-9和IL-12，其中IL-6耐鹽性最強(qiáng)。3個(gè)耐鹽株系的染色體一小部分被父本醋栗番茄所替代，而其余染色體與母本栽培番茄Jina相同。其中L-9和IL-12株系均含有醋栗番茄第6號(hào)染色體部分片段，IL-6含有醋栗番茄第11號(hào)染色體部分片段。本研究結(jié)果表明，母本為不耐鹽番茄，而父本為耐鹽番茄，耐鹽株系的耐鹽性與其所攜帶的父本染色體滲入片段有關(guān)。后期可通過耐鹽株系與輪回母本Jina進(jìn)一步雜交并自交多代，構(gòu)建各自耐鹽系亞系群體。利用已公布的醋栗番茄LA2093基因組數(shù)據(jù)[30]，進(jìn)一步開發(fā)分子標(biāo)記對(duì)耐鹽亞系群體進(jìn)行基因分型并結(jié)合耐鹽性鑒定，挖掘耐鹽關(guān)鍵基因。利用耐鹽漸滲系株系挖掘耐鹽基因已有相關(guān)報(bào)道，例如余慶輝等[9]利用耐鹽漸滲系株系IL7-5，通過加密分子標(biāo)記構(gòu)建該片段遺傳連鎖圖譜并進(jìn)行耐鹽鑒定，實(shí)現(xiàn)了Stq7b耐鹽的主效位點(diǎn)精細(xì)定位，并篩選出2個(gè)耐鹽候選基因；周龍溪[8]同樣以耐鹽漸滲系IL7-5與M82為親本構(gòu)建了IL7-5 Sub-ILs漸滲系亞系群體，通過對(duì)亞系群體進(jìn)行耐鹽性鑒定，最終發(fā)現(xiàn)苗期耐鹽主效QTLStq7位點(diǎn)和6個(gè)耐鹽候選基因。

4 結(jié)論