楊 穎, 肖亦辰, 馬 平, 趙冬敏, 章麗嬌, 李 銀, 劉青濤, 楊 婧, 劉宇卓, 韓凱凱, 黃欣梅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇南京210014；3.國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014；4.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京210095)

星狀病毒(Astrovirus)是一種無囊膜，單股正鏈的RNA病毒，其基因組全長6.2～7.8 kb，包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3個開放閱讀框以及5′UTR、3′UTR和PolyA尾[1]。星狀病毒科包括哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬2個屬。哺乳動物星狀病毒屬可導致人、豬、牛、羊、貓和犬等多種哺乳動物患胃腸炎、腦膜炎和腹瀉疾病[2-4]。禽星狀病毒屬可引起鴨致死性肝炎[5]，雞的發(fā)育不良綜合征[6]、白雞綜合征[7]、火雞的家禽腸炎死亡綜合征[8]等。

Bidin等[9]從克羅地亞地區(qū)鵝群中分離到禽星狀病毒屬中的禽腎炎病毒(Avian nephritis virus, ANV)，并證實該星狀病毒在鵝場中普遍存在，可導致鵝胚胎發(fā)育障礙及孵化階段死亡。Zhang等[10]從湖南省具有腸炎癥狀的雛鵝體內(nèi)鑒定出1株鵝源星狀病毒(Goose astrovirus, GoAstV)FLX株?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，與禽星狀病毒屬其他成員相比，鵝星狀病毒FLX株的基因組核苷酸同源性為51%～59%，3個開放閱讀框的氨基酸同源性低于66%，是禽星狀病毒屬中新出現(xiàn)的一種鵝源星狀病毒。2017年至2019年，有研究者從國內(nèi)鵝群中分離到鵝源星狀病毒SCCD株和AHDY株，遺傳序列分析結(jié)果表明，SCCD株和AHDY株與FLX株編碼衣殼蛋白的ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸同源性為81%，遺傳距離為0.189。國際病毒分類學委員會星狀病毒研究小組規(guī)定，不同星狀病毒毒株的ORF2基因編碼氨基酸同源性若大于75%，可劃分為同一星狀病毒種，如果遺傳距離大于0.05，ORF2基因核苷酸同源性小于93%，可定義為變異株，因此有學者將SCCD株和AHDY株定義為鵝星狀病毒FLX株的變異株[11]。

2016年以來，中國主要養(yǎng)鵝地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)一種以雛鵝腎炎和內(nèi)臟、關節(jié)痛風為主要特征的急性傳染病，死亡率為20.0%～50.0%，給中國養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟損失達1.2×109～1.5×109元[12]。多位研究者從具有痛風癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到一種新的星狀病毒，包括GD、AHQJ18、SDPY、JSHA、CXZ18和SD01等毒株[13-18]?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，這些從具有痛風癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到的鵝星狀病毒與禽星狀病毒屬其他代表性毒株的基因組核苷酸同源性為46.5%～62.0%，與ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性僅為27.3%～57.0%，遺傳距離較遠。與引起腸炎的鵝星狀病毒FLX株相比，引起痛風癥狀的鵝星狀病毒ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸相似性為40.4%～42.5%，低于同種星狀病毒的劃分標準(75.0%)，是一種新的鵝星狀病毒種，因此許多學者將引起雛鵝痛風的鵝星狀病毒定義為新型鵝星狀病毒。也有學者將這2種鵝星狀病毒分別定義為鵝星狀病毒1(GoAstV1)和鵝星狀病毒2(GoAstV2)[19]，或者是鵝星狀病毒G-I群和鵝星狀病毒G-II群[20]。目前對這2種鵝星狀病毒還未有統(tǒng)一的命名方式，本文暫時將引起鵝腸炎的毒株稱為鵝星狀病毒變異株，將引起雛鵝痛風的毒株稱為新型鵝星狀病毒。

張玉杰等[11]對臨床采集的典型雛鵝痛風樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)約有94.03%的樣品為鵝星狀病毒變異株和新型鵝星狀病毒混合感染，動物試驗結(jié)果表明2種鵝星狀病毒混合感染引起的痛風癥狀及死亡率要高于單獨感染組。本實驗室在前期流行病學調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)生雛鵝痛風的鵝群中，可從部分泄殖腔拭子中同時檢測出2種鵝星狀病毒[21]。這些結(jié)果表明，臨床上存在鵝星狀病毒變異株和新型鵝星狀病毒混合感染的情況，這2種鵝星狀病毒在雛鵝痛風中發(fā)揮的作用及致病機制還有待進一步深入研究。目前還未有同時鑒別區(qū)分2種鵝星狀病毒感染的診斷方法。傳統(tǒng)的病原分離鑒定存在耗時長，對人員設備要求高等缺點。因此，建立一種可同時快速檢測2種鵝星狀病毒的方法具有重要的臨床意義。本研究擬根據(jù)新型鵝星狀病毒的ORF2基因和鵝星狀病毒變異株的ORF1a基因序列分別設計特異性引物，對反應體系和條件進行優(yōu)化，建立快速、靈敏、準確的一步法雙重RT-PCR檢測方法，以期為2種鵝星狀病毒的臨床鑒別診斷，流行病學調(diào)查以及有效防控雛鵝痛風提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

新型鵝星狀病毒(nGoAstV) AHQJ18株、鵝星狀病毒變異株(vGoAstV) 33-3株、坦布蘇病毒(TMUV)、鵝細小病毒(GPV)、鵝副黏病毒(GPMV)、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門菌(Salmonella)和雞肝癌細胞系(LMH)等由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細胞、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ購自寶生物工程(大連) 有限公司；DNA/RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒等購自愛思進生物技術( 杭州) 有限公司；一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank收錄的新型鵝星狀病毒ORF2基因和鵝星狀病毒變異株ORF1a基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件分別設計了1對特異性引物，引物信息見表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 本試驗所用引物序列及產(chǎn)物長度

1.4 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一RT-PCR擴增

分別取200 μl新型鵝星狀病毒陽性LMH細胞培養(yǎng)物和鵝星狀病毒變異株陽性鵝胚尿囊液，用RNA提取試劑盒提取病毒核酸，利用新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的特異性引物，分別進行單一的一步法RT-PCR擴增。擴增反應體系為：2×一步法反應緩沖液12.50 μl，酶混合物 1.25 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μl， RNA模板 2.00 μl，ddH2O補足至25.00 μl，混勻。新型鵝星狀病毒的反應程序為：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。鵝星狀病毒變異株的反應程序為：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 重組質(zhì)粒標準品的制備

用膠回收試劑盒分別回收上述RT-PCR擴增條帶，克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ進行雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。提取序列正確的重組質(zhì)粒，測定質(zhì)量濃度并計算質(zhì)?？截悢?shù)，作為質(zhì)粒標準品。

1.6 一步法雙重RT-PCR檢測方法的建立及反應條件優(yōu)化

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株陽性培養(yǎng)物等量混合后提取RNA作為模板，建立一步法雙重RT-PCR檢測方法。固定反應體系中其他組分不變，單一改變引物用量來確定最適的引物濃度。引物nGoAstV-F、nGoAstV-R和vGoAstV-F、vGoAstV-R的濃度均為10 μmol/L，加入量設0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl、0.9 μl 5個梯度。反應程序為：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

選擇上述篩選的最佳引物用量，單一改變退火溫度，設置52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃ 8個梯度退火溫度，進行一步法雙重RT-PCR擴增，確定最佳退火溫度。

1.7 一步法雙重RT-PCR檢測方法的特異性試驗

用上述優(yōu)化好的反應體系和條件，分別檢測新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一和混合樣品，以及坦布蘇病毒、鵝細小病毒、鵝副黏病毒、H9N2亞型禽流感病毒、大腸桿菌和沙門菌單一樣品，同時設置生理鹽水為陰性對照，用建立的一步法雙重RT-PCR方法進行擴增檢測，檢驗該方法的特異性。

1.8 一步法雙重RT-PCR檢測方法的敏感性試驗

將構建好的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標準品等體積混合，用ddH2O進行10倍梯度稀釋，取1×10-2～1×10-109個稀釋度各2 μl混合質(zhì)粒作為模板進行一步法雙重RT-PCR擴增，以檢驗該方法的敏感性。

1.9 一步法雙重RT-PCR檢測方法的重復性試驗

用建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法對3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽性的樣品進行3次重復檢測，以檢驗該方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測

對2020年江蘇地區(qū)124份21日齡內(nèi)揚州白鵝泄殖腔拭子樣本分別用本研究建立的單一和雙重RT-PCR方法檢測其中的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株，以評價該一步法雙重RT- PCR檢測方法的臨床實用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一RT-PCR擴增及重組質(zhì)粒標準品的構建

以提取的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株RNA為模板，利用引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R分別進行單一的一步法RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，新型鵝星狀病毒目的基因片段大小為658 bp，鵝星狀病毒變異株目的基因片段大小為381 bp，與預期片段大小相符。

將2個目的基因片段分別回收純化后連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5αE.coli，提取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測結(jié)果顯示，酶切片段與預期大小相符(圖2)。測序后經(jīng)NCBI BLAST比較分析發(fā)現(xiàn)，2個目的基因片段與新型鵝星狀病毒(GenBank登錄號：MF772821.1)和鵝星狀病毒變異株(GenBank登錄號：MH410610.1)的同源性分別為98.2%和97.6%，表明陽性重組質(zhì)粒標準品構建成功。用超微量分光光度計測定pMD19T-nGoAstV和pMD19T-vGoAstV的質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度分別為62.83 ng/μl和57.40 ng/μl，計算其拷貝數(shù)分別為1 μl 1.71×1010拷貝和1 μl 1.70×1010拷貝。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒；2：陰性對照；3：鵝星狀病毒變異株；4：陰性對照。圖1 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一RT-PCR擴增Fig.1 The single RT-PCR amplification of novel goose astrovirus and variant of goose astrovirus

M：DL5 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒質(zhì)粒標準品pMD19T-nGoAstV酶切鑒定； 2：鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標準品pMD19T-vGoAstV酶切鑒定。圖2 重組質(zhì)粒標準品的酶切鑒定Fig.2 Identification of standard recombinant plasmids digested by Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ

2.2 一步法雙重RT-PCR檢測方法的建立及反應條件優(yōu)化

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株陽性培養(yǎng)物等量混合后提取RNA作為模板，用引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R進行一步法雙重RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，可同時擴增出658 bp和381 bp 2個條帶，與單一RT-PCR擴增條帶大小相同，陰性對照未擴增出任何條帶(圖3)。

固定其他條件不變，對加入的引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R設置0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl和0.9 μl 5個梯度，進行一步法雙重RT-PCR擴增。結(jié)果顯示，當2對上、下游引物(10 μmol/L)各加入0.5 μl時即可獲得較高的擴增效率，因此確定引物最適用量為0.5 μl(圖4)。

固定其他反應條件不變，2對引物用量均為0.5 μl，在RT-PCR擴增時設置52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃ 8個退火溫度梯度，結(jié)果顯示，退火溫度為57.6 ℃及以下時，目的條帶均較亮，最終確定 57.6 ℃為最佳退火溫度(圖5)。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株一步法雙重RT-PCR擴增產(chǎn)物；2：陰性對照。圖3 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株一步法雙重RT-PCR擴增Fig.3 The one-step duplex RT-PCR amplification of novel goose astrovirus and variant of goose astrovirus

M：DL2 000 DNA marker；1～5：引物用量依次為0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl、0.9 μl。圖4 一步法雙重RT-PCR引物用量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of primer dosage for the one-step duplex RT-PCR

M：DL2 000 DNA marker；1～8：退火溫度依次為52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃。圖5 一步法雙重RT-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of annealing temperature for the one-step duplex RT-PCR

2.3 一步法雙重RT-PCR檢測方法的特異性試驗

應用優(yōu)化的一步法雙重RT-PCR檢測方法分別對新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一和混合陽性樣品以及坦布蘇病毒、鵝細小病毒、鵝副黏病毒、H9N2亞型禽流感病毒、大腸桿菌和沙門菌進行檢測，結(jié)果(圖6)顯示，2種鵝星狀病毒的單一樣品和混合樣品均能擴增出與預期一致的特異性條帶，而其他病原菌均未擴增出特異性條帶，說明該方法具有較高的特異性。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒；2：鵝星狀病毒變異株；3：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株；4：坦布蘇病毒；5:鵝細小病毒；6：鵝副黏病毒；7： H9N2亞型禽流感病毒；8：大腸桿菌；9：沙門菌；10：陰性對照。圖6 一步法雙重RT-PCR檢測方法的特異性試驗Fig.6 Specificity test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.4 一步法雙重RT-PCR檢測方法的敏感性試驗

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標準品等體積混合后進行10倍梯度稀釋，取1×10-2～1×10-109個稀釋度各2 μl混合質(zhì)粒為模板，用建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法進行擴增，結(jié)果(圖7)顯示，當混合質(zhì)粒標準品稀釋至1×10-7時仍能同時檢測出2種鵝星狀病毒的特異性條帶，即對新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的最低檢出量分別為1 μl 1.71×103拷貝和1 μl 1.70×103拷貝，表明該方法具有良好的敏感性。

M：DL2 000 DNA marker；1～9：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株混合質(zhì)粒標準品稀釋度分別為10-2～10-10；10：陰性對照。圖7 一步法雙重RT-PCR檢測方法的敏感性試驗Fig.7 Sensitivity test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.5 一步法雙重RT-PCR檢測方法的重復性試驗

用建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法對3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽性的樣品進行3次重復檢測，均能同時擴增出2種鵝星狀病毒的特異性條帶(圖8)，表明該方法具有良好的重復性。

M：DL2 000 DNA marker；1～3、5～7、9～11：3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽性樣品的3次重復性檢測；4、8、12：陰性對照。圖8 一步法雙重RT-PCR檢測方法的重復性試驗Fig.8 Repeatability test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.6 臨床樣品的檢測

用本研究建立的單一和一步法雙重RT-PCR方法分別對2020年江蘇地區(qū)124份21日齡內(nèi)揚州白鵝泄殖腔拭子樣本中的2種鵝星狀病毒進行檢測。在124份雛鵝泄殖腔拭子樣本中，新型鵝星狀病毒陽性樣本56份，陽性率為45.16%；鵝星狀病毒變異株陽性樣本35份，陽性率為28.23%；2種鵝星狀病毒均為陽性的樣本14份，陽性率為11.29%。檢測結(jié)果與單一RT-PCR方法結(jié)果一致，符合率為100.00%。表明本研究建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法可以對臨床樣品中的2種鵝星狀病毒進行鑒別診斷。

3 討論

2016年以來，中國主要養(yǎng)鵝地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)一種以腎炎、痛風為主要特征的傳染病，對中國養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。該病主要影響21日齡以內(nèi)的雛鵝，患病雛鵝食欲減退、精神沉郁、腹瀉，死亡率高達50%。剖檢可見多個內(nèi)臟器官表面及關節(jié)內(nèi)有白色尿酸鹽樣滲出物，膽囊腫大，內(nèi)有尿酸鹽沉積，腎臟腫脹，輸尿管內(nèi)有白色尿酸鹽樣沉積物。國內(nèi)多位學者從具有痛風癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到一種新的星狀病毒[13-18]，基因序列分析結(jié)果表明，這些鵝星狀病毒與禽星狀病毒屬其他代表性毒株的基因組核苷酸同源性較低，遺傳距離較遠，是一種新的鵝星狀病毒種，因此許多學者將引起雛鵝痛風的鵝星狀病毒定義為新型鵝星狀病毒。

Zhang等[10]從具有腸炎癥狀的雛鵝體內(nèi)鑒定出1株鵝源星狀病毒FLX株。之后有學者從臨床鵝群中分離到與新型鵝星狀病毒不同的鵝源星狀病毒。遺傳序列分析結(jié)果表明，這些鵝源星狀病毒與鵝星狀病毒FLX株為同一星狀病毒種，但存在一定的遺傳距離，可定義為變異株，本文暫時稱為鵝星狀病毒變異株。鵝星狀病毒變異株與新型鵝星狀病毒的ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸同源性為40.4%～42.5%，低于同種星狀病毒的劃分標準75.0%，是2種不同的星狀病毒種。有文獻報道，在臨床發(fā)生痛風癥狀的鵝群內(nèi)存在2種鵝星狀病毒混合感染的情況，動物試驗結(jié)果表明，2種鵝星狀病毒混合感染引起的痛風癥狀及死亡率要高于單獨感染組[11,21]。但這2種鵝星狀病毒在雛鵝痛風中發(fā)揮的具體作用及致病機制還有待進一步深入研究。

目前國內(nèi)對于2種鵝星狀病毒的研究均處于初期階段[22-23]，僅有單獨檢測新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的RT-PCR方法或?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法[24-25]，還沒有同時鑒別區(qū)分2種鵝星狀病毒感染的診斷方法。因此，本研究建立了一種一步法雙重RT-PCR檢測方法，可以同時、準確、快速、簡便地檢測這2種鵝星狀病毒，具有重要的臨床意義。

傳統(tǒng)的病原分離鑒定存在耗時長，對人員設備要求高等缺點。RT-PCR技術是一種比較成熟的核酸擴增檢測技術，而且擴增出的特異性片段可以進行基因測序，進一步進行遺傳進化分析。2種鵝星狀病毒均為RNA病毒，檢測時需先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增。本研究采用一步法RT-PCR方法，減少了操作步驟，降低了樣本被污染的風險，提高了檢測效率。

本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒的ORF2基因和鵝星狀病毒變異株的ORF1a基因的保守區(qū)域分別設計了特異性引物，并對反應體系及反應條件進行優(yōu)化，確定了最佳引物使用量和退火溫度，首次建立了針對這2種鵝星狀病毒的一步法雙重RT-PCR檢測方法。該方法可在同一反應體系中擴增出新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的2個特異性條帶，對其他鵝常見病毒性和細菌性病原的檢測結(jié)果均為陰性，具有較高的特異性。本研究建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法對新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的最低檢測量分別是1 μl 1.71×103拷貝和1 μl 1.70×103拷貝，具有良好的敏感性，同時具有較好的重復性。應用已建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法對臨床采集的雛鵝泄殖腔拭子樣本進行檢測，結(jié)果顯示，124份雛鵝泄殖腔拭子中新型鵝星狀病毒陽性率為45.16%，鵝星狀病毒變異株陽性率為28.23%，2種鵝星狀病毒均為陽性的占11.29%，證實臨床上鵝群中確實存在2種鵝星狀病毒混合感染的情況。檢測結(jié)果與單一RT-PCR方法檢測結(jié)果一致，符合率為100.00%。

本研究建立的檢測新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的一步法雙重RT-PCR檢測方法具有操作簡便，靈敏度高，特異性強的特點，可以快速高效地檢測出2種鵝星狀病毒，為上述2種病毒病的流行病學調(diào)查和臨床早期鑒別診斷提供技術支持，對2種鵝星狀病毒病的病原監(jiān)測和有效防控以及混合感染的致病性研究具有重要意義。