段江曼, 劉寧, 周歡歡, 湯躍強(qiáng), 付曉紅, 孫杰, 周啟明△

華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)科, 2血液內(nèi)科(廣東深圳 518052)

胃癌的發(fā)病率和病死率均列于所有惡性腫瘤的前3位，5年生存率不足10%。侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后不良的重要原因[1-2]。胃癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑是血行轉(zhuǎn)移、腹膜種植轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移，其中肝臟是胃癌血行轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位，3.5%～14.0%的胃癌患者可發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[3]。當(dāng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，多失去手術(shù)指征而采用化療及靶向藥物等姑息性治療，且預(yù)后非常差，中位生存期為3～13個(gè)月[4]。目前胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明，因此研究胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)其進(jìn)行早期防控與治療，提高患者生存率具有重要的意義?？p隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊參與腫瘤微環(huán)境改造。有研究證據(jù)顯示，Cx43具有與腫瘤抑制因子類似的功能[5-6]，修復(fù)Cx43可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。更多的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Cx43可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。以Cx43建立的癌細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接顯著促進(jìn)了腦轉(zhuǎn)移[8]。Cx43介導(dǎo)的縫隙連接有助于胃癌細(xì)胞的腹膜浸潤(rùn)[9]。Cx43可與巨噬細(xì)胞[10]、成纖維細(xì)胞[11]、內(nèi)皮細(xì)胞[12]、間皮細(xì)胞[9]等發(fā)生縫隙連接，參與腫瘤細(xì)胞對(duì)自身微環(huán)境的改造和定植生長(zhǎng)。同時(shí)，肝巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)可極化為M2型巨噬細(xì)胞，腫瘤的低氧微環(huán)境可誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)多種促血管生成因子和細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等[13]，從而對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行改造，加速腫瘤的進(jìn)展。研究表明cAMP可促進(jìn)細(xì)胞IL-10的表達(dá)，而在細(xì)胞通訊過(guò)程中，縫隙連接通道常常傳輸cAMP來(lái)進(jìn)行細(xì)胞間的交互作用[14]。然而，對(duì)于胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中胃癌細(xì)胞如何調(diào)控其腫瘤微環(huán)境知之甚少。因此，本研究旨在探討Cx43在胃癌中的表達(dá)、預(yù)后及在胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中如何參與腫瘤微環(huán)境改造。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入胃癌的140例患者的組織切片進(jìn)行分析，同時(shí)收取5例新鮮胃癌組織及對(duì)應(yīng)肝轉(zhuǎn)移瘤組織，所有臨床樣本均按照離體 40 min 內(nèi)經(jīng)液氮速凍后保存于液氮罐的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行保存。所有樣本在收集前通過(guò)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意，符合指南規(guī)定。納入收入的標(biāo)本已臨床病理診斷確診為胃癌。

1.2 免疫組化實(shí)驗(yàn) 將收集的胃癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片、常規(guī)脫蠟、水化等處理，過(guò)氧化物酶阻斷及非免疫血清孵育后，依次加入Anti-Cx43一抗及生物素標(biāo)記的二抗孵育，DAB顯色。

使用半定量方法對(duì)腫瘤組織中的Cx43表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分。免疫染色強(qiáng)度評(píng)分如下：0(陰性)、1(弱)、2(中等)和3(強(qiáng))。根據(jù)面積百分比量化免疫染色的程度：0(無(wú)陽(yáng)性染色)、1(<10%)、2(10%～50%)或3(>50%)。范圍和強(qiáng)度分?jǐn)?shù)的總和是最終的染色分?jǐn)?shù)(0～6)。分?jǐn)?shù)≤3被認(rèn)為低表達(dá)，而分?jǐn)?shù)≥4被認(rèn)為是高表達(dá)。

1.3 熒光定量RT-PCR Trizol 裂解液提取細(xì)胞總 RNA，測(cè)定 RNA 濃度及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將 RNA 逆轉(zhuǎn)為 cDNA，采用 SYBR? Green 染料法進(jìn)行熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)，GAPDH作為內(nèi)參。采Primer5.0設(shè)計(jì)各待測(cè)基因的上、下游引物，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.4 Western blot 細(xì)胞溶解液抽提組織蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量。進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用一抗、內(nèi)參抗體 4℃封閉過(guò)夜, 再用含辣根過(guò)氧化酶二抗室溫孵育 1 h，洗膜后，ECL 化學(xué)發(fā)光后，觀察蛋白的變化，進(jìn)行半定量分析。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 將胃癌細(xì)胞-肝巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基，對(duì)胃癌細(xì)胞刺激18 h左右，將其制成單細(xì)胞懸液，接種至 96孔培養(yǎng)板中(500～1 000個(gè)細(xì)胞/孔)，0～5 d各加入MTT液(2 mg/mL)20 μL/孔，每次5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO(150 μL/孔)，使結(jié)晶物融解。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 570 nm，繪制細(xì)胞活力曲線圖。

1.6 細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。消化并收集細(xì)胞，PBS洗2次，重懸于結(jié)合液中，吹打成單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液與Annexin V-FITC及PI于室溫下黑暗處孵育15 min，利用流式細(xì)胞儀(FACScalibur，BD公司)檢測(cè)， CellQuest分析軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8(GraphPad Software)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Kaplan-Meier方法檢驗(yàn)Cx43的表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系。MTT實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，余PCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student′s-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43在胃癌組織中的表達(dá) Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示27種腫瘤中存在Cx43突變，其中胃癌中Cx43突變概率位列第三(圖1-A)。胃癌組織中Cx43(GJA1)的mRNA的表達(dá)低于癌旁組織(圖1-B)。通過(guò)免疫組化進(jìn)行臨床驗(yàn)證我們得到了一致性結(jié)果，胃癌患者癌組織中的Cx43蛋白表達(dá)低于癌旁組織(圖1-C)。此外，根據(jù)免疫組化評(píng)分，納入研究的140例胃癌患者組織中62例患者 Cx43 的表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為44.29%；癌旁胃正常組織則有128例 Cx43 表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為 91.43%，兩者 Cx43 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：A：Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中不同癌種Cx43的突變頻率； B：Timer2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中不同癌種Cx43基因在癌組織及癌旁組織的表達(dá)； C：140例胃癌患者Cx43在癌組織及癌旁組織的蛋白表達(dá)

2.2 胃癌患者Cx43的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 140例胃癌患者，隨訪時(shí)間為0.5～3年(2018—2021年)，通過(guò)胃癌組織中Cx43蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)(性別、年齡、TNM分期、臨床分期，分化程度)進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示Cx43蛋白在胃癌組織的表達(dá)水平與胃癌患者的臨床分期，浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者Cx43的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 Cx43表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 利用oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)(圖2-A)、kmplot數(shù)據(jù)庫(kù)(圖2-B)及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(圖2-C)中胃癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，均發(fā)現(xiàn)Cx43(GJA1)表達(dá)越高，胃癌患者的生存率越低。我們對(duì)納入的140例胃癌患者進(jìn)行Kaplan-Meier存活曲線分析，發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)越高，胃癌患者的預(yù)后越差(圖2-D)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：A：oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者Cx43的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系； B：kmplot數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者Cx43的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系； C：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者Cx43的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系； D：納入的140例胃癌患者Cx43的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.4 Cx43在胃癌肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) 針對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者的Cx43 mRNA表達(dá)水平結(jié)果分析提示，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織中Cx43表達(dá)低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加入發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者數(shù)據(jù)后，該差異消失(圖3-A、B)。對(duì)5例胃癌肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本中胃癌組織、癌旁組織及肝轉(zhuǎn)移組織分別進(jìn)行Cx43蛋白水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cx43胃癌原發(fā)灶中表達(dá)最低，癌周正常組織其次，肝轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)最高(P<0.01，圖3-C)。

注：A：TCGA數(shù)據(jù)褲中無(wú)肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織與癌旁組織Cx43的基因表達(dá)； B：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包含肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織與癌旁組織Cx43的基因表達(dá)； C：胃癌患者新鮮組織Cx43的蛋白表達(dá)。*為P<0.05，Tumor：胃癌組織；Non-Tumor：癌旁組織，HM：肝轉(zhuǎn)移組織

2.5 Cx43介導(dǎo)的癌細(xì)胞-肝巨噬細(xì)胞縫隙連接促進(jìn)胃癌肝轉(zhuǎn)移 檢測(cè)永生化上皮細(xì)胞GES-1與5株胃癌細(xì)胞(MNK-45、SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS)中Cx43的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Cx43在胃癌細(xì)胞中表達(dá)均低于GES-1，5株胃癌細(xì)胞中MGC-803細(xì)胞Cx43低表達(dá)，BGC-823細(xì)胞相對(duì)Cx43高表達(dá)。將肝巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和胃癌細(xì)胞MGC-803/BGC-823共培養(yǎng)后，收集其條件培養(yǎng)基，重新對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組明顯增高，見(jiàn)表2。

表2 Cx43在不同培養(yǎng)基刺激胃癌細(xì)胞后的基因水平表達(dá)

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞活力，提示胃癌細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基刺激后可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞MGC-803/BGC-823的增殖率，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3～4。

表3 條件培養(yǎng)基刺激MGC803胃癌細(xì)胞的活力測(cè)定

表4 條件培養(yǎng)基刺激BGC823胃癌細(xì)胞的活力測(cè)定

加入胃癌常用化療藥物奧沙利鉑后，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑對(duì)條件培養(yǎng)基刺激的腫瘤細(xì)胞MGC-803/BGC-823凋亡作用明顯下降(P<0.001,圖4)。

注： ***為P<0.001

2.6 Cx43促進(jìn)胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程可能參與的信號(hào)通路 我們利用熒光RT-PCR檢測(cè)與癌細(xì)胞共培養(yǎng)18 h后Kupffer細(xì)胞中不同細(xì)胞因子或促血管生成因子的表達(dá)，例如TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、VEGF mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IL-10的mRNA表達(dá)明顯增加(圖5)。

圖5Kupffer細(xì)胞中多種因子的表達(dá)

將胃癌細(xì)胞利用cAMP抑制劑SQ22536處理18 h后與肝巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)IL-10的表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，加入cAMP抑制劑的胃癌細(xì)胞中 IL-10表達(dá)下降(表5)。

表5 IL-10在加入cAMP抑制劑后的基因表達(dá)水平

此外，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染沉默Cx43的胃癌細(xì)胞MGC-803與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測(cè)Kupffer細(xì)胞中中IL-10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基刺激后，沉默組的IL-10表達(dá)明顯下降(表6)。

表6 不同條件培養(yǎng)基刺激后IL-10的基因表達(dá)水平

利用Western blot檢測(cè)Cx43沉默組與對(duì)照組癌細(xì)胞中p-STAT3、STAT3的表達(dá)改變情況。當(dāng)無(wú)條件培養(yǎng)基刺激時(shí)，STAT3信號(hào)通路激活不明顯；條件培養(yǎng)基刺激后，沉默Cx43組(sh1、sh2)，p-STAT3、CyclinD1均較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖6 不同條件培養(yǎng)基刺激后STAT3、CyclinD1的蛋白表達(dá)

3 討論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。不少研究提示縫隙連接與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系[15]。Cx43是目前已知在人體內(nèi)分布廣泛，與腫瘤關(guān)系最為密切的縫隙連接蛋白。在不同癌種中均有表達(dá)[16-17]，也有研究通過(guò)電鏡觀察到胃癌組織中 CX43 介導(dǎo)的縫隙連接遭到破壞，且破壞程度與惡性程度呈正相關(guān)，由此推斷 CX43 介導(dǎo)的縫隙連接功能降低可能是促癌變階段的重要機(jī)制[18]。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)胃癌原發(fā)灶中Cx43表達(dá)低于癌旁組織，免疫組化得到驗(yàn)證。我們的研究發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度有關(guān)，分期越晚，Cx43的表達(dá)越高，總生存期越短，說(shuō)明Cx43表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。有研究指出 Cx43 在原發(fā)性骨腫瘤中作為腫瘤抑制因子的同時(shí)也可作為腫瘤促進(jìn)因子在腫瘤的發(fā)展中起著拮抗作用[19]。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者的Cx43 mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，與正常組相比，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌患者中Cx43表達(dá)下降，加入發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者數(shù)據(jù)后，該差異消失。Cx43參與了胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程，然而具體作用機(jī)制尚不可知。

在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有著相互作用的關(guān)系。浸潤(rùn)在腫瘤中的巨噬細(xì)胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages, TAMs)，在腫瘤免疫逃逸階段，腫瘤微環(huán)境的改變會(huì)使TAMs向M2型巨噬細(xì)胞分化[13]，M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管形成和侵襲等多種途徑使腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[20]。有研究提示，M2型巨噬細(xì)胞參與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移[13]和肝細(xì)胞癌進(jìn)展[21]。常駐肝臟中的巨噬細(xì)胞是Kupffer細(xì)胞，也是人體內(nèi)最大的組織巨噬細(xì)胞。我們研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞能與肝巨噬細(xì)胞形成由Cx43介導(dǎo)的縫隙連接，促進(jìn)胃癌細(xì)胞在有肝巨噬細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境中增殖。M2型巨噬細(xì)胞可分泌IL-10、TNF-β等細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，參與免疫抑制、組織重塑與修復(fù)及血管生成[22]。通過(guò)檢測(cè)與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后肝巨噬細(xì)胞中多種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IL-10表達(dá)明顯高于其他細(xì)胞因子，但I(xiàn)L-10的表達(dá)與條件培養(yǎng)基的不同是否有相關(guān)性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在細(xì)胞通訊過(guò)程中，縫隙連接通道常常傳輸cAMP來(lái)進(jìn)行細(xì)胞間的交互作用。cAMP在真核生物中的主要功能是激活PKA。PKA在其轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)絲氨酸133處促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的磷酸化[23]。一旦被磷酸化，CREB參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、存活、分化等[24]。已有研究顯示CREB誘導(dǎo)具有CRE元件的免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、環(huán)氧合酶-2和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子[23]。有研究發(fā)現(xiàn)與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著刺激癌細(xì)胞中的STAT3通路激活，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和進(jìn)展[25]。STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族一員，與細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)。激活的STAT3與細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)升高相關(guān)[26]，并且在胃癌中STAT3和cyclin D1過(guò)表達(dá)激活參與了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[27]。我們研究發(fā)現(xiàn)cAMP與IL-10的表達(dá)具有一致性，p-STAT3及CyclinD1與Cx43的表達(dá)一致，綜上，我們發(fā)現(xiàn)Cx43介導(dǎo)縫隙連接使胃癌細(xì)胞與肝巨噬細(xì)胞形成交互作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞在肝臟中增殖，而cAMP、IL-10、STAT3及CyclinD1等分子參與了這一腫瘤微環(huán)境的改變。但是目前結(jié)果不足以說(shuō)明cAMP促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，繼而激活下游STAT3信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)增殖。

我們首次報(bào)道了Cx43在胃癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的作用，癌細(xì)胞通過(guò)由Cx43介導(dǎo)的縫隙連接與肝巨噬細(xì)胞形成交互作用，通過(guò)該縫隙連接傳輸cAMP至肝巨噬細(xì)胞，促進(jìn)肝巨噬細(xì)胞旁分泌IL-10，并探索了可能參與的信號(hào)通路，但這些結(jié)果仍需要一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證及深入挖掘。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移的研究提供了新思路，深入研究可能對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展提供新的靶點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明論文內(nèi)容不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文撰寫(xiě)為段江曼，臨床資料收集與統(tǒng)計(jì)為劉寧，周歡歡、湯躍強(qiáng)、付曉紅進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施，評(píng)估與指導(dǎo)為孫杰，周啟明審校。