周蜜, 許文芳, 陳將南, 張寶軍, 王章善, 付雙杏, 方曉波

紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 1皮膚科， 2檢驗(yàn)科(浙江紹興 312000)

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起的一種良性細(xì)胞增殖性疾病，CA組織類(lèi)似良性腫瘤。CA主要感染群體為21～50歲的中青年男女[1]。HPV能引起人體皮膚黏膜鱗狀上皮細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為尋常疣、CA等癥狀[2]。一般感染低危型HPV可引起生殖道、陰莖、宮頸等部位病損，而高危型HPV可引起反復(fù)、持續(xù)感染[3]。目前臨床上低危型HPV是CA的主要發(fā)病原因，低危型中以HPV6、HPV11兩種最為常見(jiàn)[4]。miR-149-3p在多種癌癥類(lèi)型的腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用。Zhou等[5]研究顯示，低表達(dá)miR-149-3p可促進(jìn)宮頸癌遷移和侵襲。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是醫(yī)學(xué)界近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物，主要表達(dá)于生殖系統(tǒng)上皮細(xì)胞[6]。Shi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中miR-149可通過(guò)調(diào)控WFDC2(編碼HE4蛋白的基因)。因此，本研究選取CA患者80例為研究對(duì)象，探究miR-149-3p、HE4在CA組織中表達(dá)及與HPV感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年8月本院收治的80例CA患者為研究對(duì)象(CA組)，年齡22～56歲，平均(37.18±8.93)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合CA診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)入組前未經(jīng)任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他惡性腫瘤；(2)伴梅毒、艾滋病、生殖器皰疹等其他性病、增生性皮膚??；(3)既往有外生殖器疾病史；(4)1個(gè)月內(nèi)服用免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素。另選取50例在本院行包皮環(huán)切術(shù)患者為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：行包皮環(huán)切術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)同CA組排除標(biāo)準(zhǔn)相同且無(wú)HPV感染。對(duì)照組年齡20～54歲，平均(35.42±8.86)歲。CA組、對(duì)照組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 組織取樣：CA組患者在本院就診時(shí)切下疣體組織，分兩份，置于液氮中保存，然后凍存于-80℃。對(duì)照組于本院行包皮環(huán)切術(shù)時(shí)留取正常包皮組織，置于液氮中保存，然后凍存于-80℃。

血液樣本取樣：CA組患者和對(duì)照組在本院檢查當(dāng)天，清晨空腹時(shí)抽取靜脈血6 mL，離心，留上清液，凍存于-80℃。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織中miR-149-3p的水平 使用Trizol RNA提取試劑盒(大連生物工程公司)提取組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連生物工程公司)按照操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-149-3p以管家基因U6為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)組織中miR-149-3p及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-149-3p相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.2.3 檢測(cè)組織中HE4表達(dá) 采用免疫組化法(SP法)檢測(cè)組織中HE4表達(dá)，將獲取的組織進(jìn)行石蠟包埋，二甲苯脫臘，梯度酒精水化，3%過(guò)氧化氫清除內(nèi)源性氧化物酶，再進(jìn)行抗原修復(fù)，加山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加二抗，孵育，滴加顯色液，終止反應(yīng)，復(fù)染、分化、脫水、透明、封片，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生用高倍鏡對(duì)每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行分析。按陽(yáng)性染色面積所占百分比評(píng)分：<10%計(jì)0分，10%～39%計(jì)1分，40%～69%計(jì)2分，≥70%計(jì)3分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分。兩次評(píng)分乘積為最終綜合評(píng)分，≤2分為陰性表達(dá)，>2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.4 檢測(cè)血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定血清γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin 10，IL-10)水平(試劑盒均由美國(guó)R&D公司提供)。

1.3 HPV病毒載量分析 取出CA組織，待解凍后，研磨成組織勻漿，離心2次(12 000 r/min，8 min)，沉淀經(jīng)過(guò)DNA提取裂解后，采用HPV6/11 PCR熒光檢測(cè)試劑盒處理DNA樣品。配制PCR反應(yīng)管，設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品梯度。擴(kuò)增條件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；然后93℃ 30 s，55℃ 45 s,30個(gè)循環(huán)。確定基線和閾值，基線閾值設(shè)定，設(shè)定原則為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，且Ct值為0.00。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取DNA含量，單位為DNA模板平均拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，采用2檢驗(yàn)。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Spearman法分析CA組織中miR-149-3p與HE4及miR-149-3p、HE4與IFN-γ、TNF-α、IL-10水平的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA組和對(duì)照組組織中miR-149-3p和HE4的水平比較 與對(duì)照組相比，CA組組織中miR-149-3p水平較低(P<0.05)，HE4陽(yáng)性表達(dá)率較高(P<0.05)，見(jiàn)表2、3及圖1。

表2 CA組和對(duì)照組組織中miR-149-3p的水平比較

表3 CA組和對(duì)照組組織中HE4表達(dá)比較 例

圖1CA組及對(duì)照組組織中HE4表達(dá)(×400)

2.2 CA組和對(duì)照組血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比較 與對(duì)照組相比，CA組血清IFN-γ、TNF-α水平較低(P<0.05)，血清IL-10水平較高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 CA組和對(duì)照組血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比較

2.3 CA患者組織中HPV病毒載量和miR-149-3p、HE4的水平比較 80例CA患者中HPV6/HPV11陽(yáng)性檢出率為82.50%(66/80)。與病毒載量為103～105組相比，105～107組、>107組組織中miR-149-3p水平較低(P<0.05)，HE4陽(yáng)性表達(dá)率較高(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 HPV6/HPV11陽(yáng)性CA患者組織中HPV病毒載量和miR-149-3p、HE4的水平關(guān)系

2.4 HPV6/HPV11陽(yáng)性CA患者miR-149-3p和HE4表達(dá)水平相關(guān)性分析 根據(jù)66例HPV6/HPV11陽(yáng)性CA患者miR-149-3p表達(dá)水平中位值(0.55)，將其分為miR-149-3p高表達(dá)組33例，miR-149-3p低表達(dá)組33例。經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，CA組織中HE4與miR-149-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.445，P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 CA組織中miR-149-3p和HE4表達(dá)水平的相關(guān)性 例

2.5 CA患者中miR-149-3p和HE4表達(dá)水平與IFN-γ、TNF-α、IL-10水平相關(guān)性分析 分析顯示，miR-149-3p與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；HE4與IFN-γ、TNF-α呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與IL-10呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 相關(guān)性分析

3 討論

HPV是一種DNA病毒，根據(jù)HPV所侵犯的上皮細(xì)胞所在部位分為生殖道型HPV和皮膚型HPV[9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，感染機(jī)體HPV后，細(xì)胞免疫可清除體內(nèi)HPV，體液免疫可防止機(jī)體被同一亞型HPV再次感染。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色，機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)，Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞可處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體被病毒感染后，兩者平衡被打破，病毒感染機(jī)體后可引起機(jī)體Th1向Th2漂移，如宮頸癌的發(fā)生[10]。Th1細(xì)胞可分泌IFN-γ、TNF-α，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞可分泌IL-10介導(dǎo)體液免疫。當(dāng)Th2細(xì)胞占優(yōu)時(shí)，Th2細(xì)胞因子會(huì)過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CA組血清IFN-γ、TNF-α血清較低，血清IL-10水平較高，提示CA患者可能存在細(xì)胞免疫功能抑制。

microRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞增殖，免疫調(diào)節(jié)等生物過(guò)程。miR-149-3p具有多種生理功能。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miR-149-3p是一種新型的癌癥相關(guān)microRNA，在抑制增殖、遷移方面發(fā)揮著重要作用[11]。Yang等[12]研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-149-3p可抑制膀胱癌的增殖、遷移和侵襲。有研究報(bào)道，miR-149-5p是調(diào)控HPV陽(yáng)性的宮頸鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)鍵因子，在HPV陽(yáng)性宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展中起關(guān)鍵作用[13]。本研究顯示CA組組織中miR-149-3p水平較對(duì)照組低，105～107組、>107組組織中miR-149-3p水平較103～105組低，提示miR-149-3p的降低可能參與CA疾病發(fā)生，且miR-149-3p水平變化可能與HPV感染有關(guān)。miR-149-3p還可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥，Shen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-149-3p過(guò)表達(dá)可抑制NF-κB信號(hào)通路并減弱TNF-α的分泌，減輕慢性阻塞性肺疾病患者炎癥反應(yīng)。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-149-3p可減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化從而抑制食管癌小鼠發(fā)生免疫逃逸，過(guò)表達(dá)miR-149-3p可降低IL-10水平。本研究顯示miR-149-3p與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)，與IL-10、HE4呈負(fù)相關(guān)，提示miR-149-3p可能與HE4、IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用調(diào)控CA病情。

HE4也稱為WFDC2，在位于人附睪遠(yuǎn)端的上皮細(xì)胞上首次發(fā)現(xiàn)其存在。HE4是一種新型腫瘤生物標(biāo)志物。有研究表明，HE4在子宮內(nèi)膜癌中具有重要的診斷價(jià)值[16]。有分子細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明，HE4可通過(guò)調(diào)控多個(gè)分子通路參與腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[17]。王元元等[18]研究顯示，HE4對(duì)宮頸癌的診斷具有較高診斷價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，CA組組織中HE4陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，105～107組、>107組組織中HE4陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于103～105組，提示HE4可能與CA疾病發(fā)生有關(guān)，且HE4水平變化可能與HPV DNA載量有關(guān)。Zhang等[19]研究顯示，卵巢癌患者血清中HE4水平與IL-10呈正相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，接受依伐卡托的囊性纖維化患者的血清HE4水平與肺功能改善程度呈負(fù)相關(guān)，囊性纖維化患者血清中HE4水平隨血清IL-10、IL-6水平升高而升高[20-21]。本研究分析顯示，CA組織中HE4與IFN-γ、TNF-α呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈正相關(guān)，提示HE4可能與IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用調(diào)控CA病情。

綜上所述，HPV6/HPV11病毒載量高CA組織中miR-149-3p表達(dá)水平較低、HE4陽(yáng)性表達(dá)率較高，miR-149-3p、HE4均與IFN-γ、TNF-α、IL-10密切相關(guān)，但本研究尚未深入探討miR-149-3p、HE4與CA發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，仍需擴(kuò)大樣本量深入探討。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：周蜜：提出研究選題、設(shè)計(jì)方案、論文撰寫(xiě)；許文芳、陳將南：實(shí)驗(yàn)操作、分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；張寶軍、王章善、付雙杏、方曉波：臨床及病理資料收集、數(shù)據(jù)整理。