孫榮道, 楊國帥, 余丹, 胡裕潔, 張江山, 肖成業(yè)

?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(海南?？?570208)

缺血性腦卒中是由于腦組織局部動脈血流灌注減少或者突然中止，導(dǎo)致腦部軟組織的壞死，具有極高的致殘率和致死率，隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出了明顯的上升趨勢[1-2]。且在存活的患者中，多數(shù)會有較為嚴(yán)重的后遺癥，嚴(yán)重影響了他們的生活質(zhì)量，也給他們帶來了巨大的精神壓力，成為我國經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展中亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。近十年來，腦卒中新的療法在動物實驗中取得較為理想的效果，但是目前已在研究中的治療方式以及藥物效果并不好，由于某些療法因成本高或嚴(yán)重的不良反應(yīng)而放棄臨床應(yīng)用[3-5]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，它是廣泛存在于組織和細(xì)胞中的一種特殊因子，上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)扁平上皮細(xì)胞的繁殖，誘導(dǎo)新的螺旋狀毛細(xì)血管形成，建立血管網(wǎng)，VEGF可參與該病病發(fā)后的腦組織缺損的修復(fù)[6-7]。不過VEGF通過哪些途徑修復(fù)及保護(hù)損傷的腦細(xì)胞還不夠明確，目前的研究認(rèn)為鉀離子通道和腦保護(hù)作用密切相關(guān)，但是具體作用機制未見有深入報告研究[8]。因此本研究主要目的是證實VEGF具有腦保護(hù)作用，同時確定腦保護(hù)作用主要鉀離子通道的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取2020年4月至2022年1月于?？谑腥嗣襻t(yī)院就診的100例缺血性腦卒中患者作為研究對象，將其根據(jù)腦卒中臨床神經(jīng)功能缺損程度評分量表(China Stroke Scale，CSS)評分分為預(yù)后較好組(n=65)和預(yù)后不良組(n=35)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合該病診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)經(jīng)CT掃描或磁共振成像確診；(3)患者家屬對本研究知情，且簽訂知情同意書；(4)首次發(fā)病，發(fā)病至入院時間<24 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腦外傷及腦部手術(shù)者；(2)既往存在精神病史者；(3)伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病患者。

經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)[2021-(倫審)-181]，患者及家屬知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 選取SD大鼠(購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(湘)2019-0004)，獲取大鼠大腦，切取皮質(zhì)，經(jīng)過酶解，獲得原液細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)液體中加入阿糖胞苷，抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長，獲得腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，運用免疫熒光組織化學(xué)法檢測神經(jīng)元Tubulinβ單克隆抗體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異的抗GFAP多克隆抗體完成皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞鑒定。調(diào)整神經(jīng)元細(xì)胞濃度為5×104個/mL。按5×104個/mL細(xì)胞濃度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中根據(jù)分組要求在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的藥物，細(xì)胞在5%低氧濃度下培養(yǎng)。然后將神經(jīng)元細(xì)胞分為空白對照組、缺氧組、低劑量VEGF組、中劑量VEGF組、高劑量VEGF組、抑制劑組。除空白對照組外，空白對照組不加藥物，且在正常氧濃度35%下培養(yǎng)；其余細(xì)胞在5%低氧濃度下培養(yǎng)，低、中、高劑量VEGF組的VEGF濃度分別為20、40、80 μmol/L；缺氧組不加藥物，抑制劑組加入奎寧200 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 檢測患者血清VEGF水平 所有患者于入院未治療前抽取外周靜脈血2 mL，3 000轉(zhuǎn)4℃離心5 min,取上清液，送專業(yè)實驗室，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測治療前(發(fā)病0 d)、1、2、7、14 d的血清VEGF水平。

1.2.2 腦卒中病情進(jìn)展評分評定 入院時采用CSS進(jìn)行評價，最低0分，最高45分，輕型0～15分，中型16～30分，重型31～45分。根據(jù)CSS評分對病情進(jìn)行分級，發(fā)病后3 d再次對病情進(jìn)展CSS評分，若評分增加5分或5分以上(和入院時比)，則納入病情進(jìn)展，若評分為5分或5分以下，為病情穩(wěn)定，預(yù)示預(yù)后較好。7 d后再次進(jìn)行CSS評分，若評分增加1分以上的(和入院時比)，則納入預(yù)后不良組(n=35)，若評分未增加，或者減少的，為病情穩(wěn)定，納入預(yù)后較好組(n=65)。

1.2.3 收集患者臨床資料 仔細(xì)詢問并記錄患者的臨床病例數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、高血壓、糖尿病、房顫史、腦卒中病史、三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、入院美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分、VEGF水平。

1.2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況 獲取細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞混懸液，首先自然晾干，經(jīng)過多聚甲醛固定，封閉后標(biāo)記顯色，采用TUNEL染色試劑盒檢測凋亡細(xì)胞，經(jīng)過圖像軟件處理，計算3個視野下0.2 mm陽性細(xì)胞計數(shù)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 WB檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，首先加入裂解液，然后在冰上用刮棒快速將細(xì)胞碎片移入離心管中，在4℃下以1 200 r/min的速度進(jìn)行離心，然后采用BCA測定細(xì)胞總蛋白，再進(jìn)行灌膠，然后加足夠電泳液進(jìn)行上樣，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，將膜用TBS浸濕后搖動封閉1 h，加入稀釋好濃度的Bcl-2、Bax、TREK抗體；室溫下孵育、脫色后，過夜后同樣方法加入二抗，再次清洗，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像，以β-actin為內(nèi)參檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 患者血清VEGF變化趨勢 100例患者血清VEGF水平在發(fā)病第0、1、2、7、14天的水平分別為(226.25±10.25)μg/L、(258.60±12.55)μg/L、(393.22±20.05)μg/L、(385.17±19.21)μg/L、(221.50±10.35)μg/L。

2.2 預(yù)后不良組和預(yù)后較好組臨床資料比較 兩組在性別、BMI、腦卒中病史、TG、TC、HDL-C、LDL-C等一般資料比較中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與預(yù)后較好組比較，預(yù)后不良組患者年齡較高，高血壓、糖尿病、房顫史者較多，入院NIHSS評分較高，VEGF水平較低(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.3 Logistic回歸分析 年齡、高血壓、糖尿病、房顫史、入院NIHSS評分、VEGF水平均為影響患者預(yù)后的危險因素，P<0.05，見表2。

表2 影響患者預(yù)后的危險因素分析

2.4 檢測各組大鼠細(xì)胞凋亡率 與空白對照組相比較，缺氧組凋亡率較高；與缺氧組比較，低、中、高劑量VEGF組、抑制劑組凋亡率較低，P<0.05；且低劑量VEGF組和抑制機組抑制作用最顯著，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4、圖1。

表4 各組大鼠細(xì)胞凋亡率比較

2.5 檢測各組大鼠細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白水平 與空白對照組比較，缺氧組Bcl-2蛋白表達(dá)較低，Bax、TREK蛋白表達(dá)較高，與缺氧組比較，低、中、高劑量VEGF組、抑制劑組Bcl-2、Bax、TREK蛋白表達(dá)均有所改善(P<0.05)；中劑量VEGF組和抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5、圖2。

表5 各組大鼠細(xì)胞Bcl-2、Bax、TREK蛋白表達(dá)比較

注：A為空白對照組；B為缺氧組；C為低劑量VEGF組；D為中劑量VEGF組；E為高劑量VEGF組；F為抑制劑組

3 討論

缺血性腦卒中是目前最常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)致死性疾病，其患病率以及死亡率較高，且較容易致殘，嚴(yán)重威脅人類健康[10]。近十年來，腦卒中新的療法在動物實驗中取得較為理想的效果，諸如亞低溫療法，干細(xì)胞治療、神經(jīng)保護(hù)劑等[11-12]，但效果欠佳。研究[13]認(rèn)為可以通過激活側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化以及遷移，繼而可以恢復(fù)部分神經(jīng)功能。然而，目前的研究起步已經(jīng)處于落后階段，且細(xì)胞移植的效果也不盡如人意，所以還需從其他角度入手[14]。目前VEGF是已知的可以作用于神經(jīng)元和神經(jīng)細(xì)胞，且具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)新生作用的因子，雖然VEGF和血管的保護(hù)和再生密切相關(guān)，但是VEGF通過哪些途徑修復(fù)及保護(hù)損傷的腦細(xì)胞還不明確。所以本研究主要探討VEGF對腦皮質(zhì)神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用以及可能的作用機制，為VEGF腦保護(hù)的機制提供理論基礎(chǔ)。

本研究中，首先對缺血性腦卒中患者血清VEGF的變化趨勢進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示，患者血清VEGF水平在治療后1、2、7 d均比治療前高，在治療后第2、7天達(dá)到高峰，第14天有所下降，但是仍然處于一個較高的水平。其次，針對患者預(yù)后不同進(jìn)行臨床資料觀察， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組在性別、BMI、腦卒中病史、TG、TC、HDL-C、LDL-C等一般資料比較中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與預(yù)后較好組比，預(yù)后不良組患者年齡較高，高血壓、糖尿病、房顫史者較多，入院NIHSS評分較高，VEGF水平較低。這說明以上指標(biāo)均與患者預(yù)后有一定的相關(guān)性?？赡苁怯捎诟啐g患者的機體功能較差，所以發(fā)生并發(fā)癥的概率就高，因此預(yù)后恢復(fù)較差。研究[15]還認(rèn)為有房顫史的患者腦梗死面積較大，病情也較嚴(yán)重，是早期不良結(jié)局的危險因素。高血糖也可能引起嚴(yán)重的血腦屏障破壞，加重腦水腫，產(chǎn)生持續(xù)的腦損傷，致使預(yù)后不良[16]。高血壓會使人體血液循環(huán)的脈動性受損，容易造成栓塞，也是公認(rèn)的導(dǎo)致不良預(yù)后的危險因素之一[17]。研究還指出入院NIHSS評分與患者腦梗死體積、部位等因素密切相關(guān)，分高的患者一般病情更重，腦組織梗死體積較大，這與患者預(yù)后不良有很大關(guān)系[18]。基于以上研究，本文對其進(jìn)行了logistic回歸分析，結(jié)果顯示年齡、高血壓、糖尿病、房顫史、入院NIHSS評分、VEGF水平均為影響患者預(yù)后的影響因素。進(jìn)一步驗證了以上結(jié)果。研究認(rèn)為VEGF不僅可以促進(jìn)血管扁平上皮細(xì)胞的增殖，還可以增加其血液循環(huán)的脈動性，并誘導(dǎo)產(chǎn)生Bcl-2凋亡蛋白[19-20]。因此，低表達(dá)的VEGF是影響患者預(yù)后最重要的危險因素，可以評估患者預(yù)后。為驗證這一點，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞實驗。

在本研究中，首先對大鼠神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了凋亡率的檢測，結(jié)果顯示缺氧組凋亡率較空白對照組升高；而與缺氧組比較，低、中、高劑量VEGF組、抑制劑組凋亡率較低，且低劑量VEGF組和抑制機組抑制作用最顯著。這說明VEGF對于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，且40 μmol/L作用最顯著。此外，Bcl-2和Bax都是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白，前者的主要作用是抑制，而后者的主要作用是促進(jìn)[21]。TREK屬于TWIK相關(guān)家族，是一種背景通道。TREK亞家族在調(diào)控細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要作用，而TREK-1是雙孔鉀通道亞型中被廣泛關(guān)注和研究的一類離子通道，在中樞人類神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，TREK-1參與了各種神經(jīng)病理疾病，如癲癇、腦卒中和抑郁癥[22]。因此，本文對以上3個蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組較空白對照組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax、TREK蛋白表達(dá)升高；而與缺氧組比較，低、中、高劑量VEGF組、抑制劑組Bcl-2、Bax、TREK蛋白表達(dá)均有所改善，且中劑量VEGF組效果最顯著。這說明，40 μmol/L的VEGF可有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能是通過TWIK相關(guān)鉀通道對患者神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)的作用。

綜上所述，VEGF對缺血性腦卒中患者具有腦保護(hù)的作用，可能是通過TWIK相關(guān)鉀通道實現(xiàn)的，這為改善患者預(yù)后、降低死亡率提供了有力的理論依據(jù)。但目前的研究主要是在細(xì)胞學(xué)、動物模型討論TWIK相關(guān)鉀通道的生理功能及作用機制，而在人群中的研究相對較少，且本研究也未進(jìn)行，還需在人群中進(jìn)行驗證和分析。

利益相關(guān)聲明：文章的全部作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程，不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：孫榮道負(fù)責(zé)實驗設(shè)計，楊國帥負(fù)責(zé)實驗實施，余丹負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)演算，胡裕潔負(fù)責(zé)整理數(shù)據(jù)，張江山負(fù)責(zé)實驗指標(biāo)監(jiān)測，肖成業(yè)負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析、論文撰寫。