代麗麗, 葛靜, 王景, 劉晶, 王旭, 陳然

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(河北石家莊 050030)

子宮內(nèi)膜癌是婦女生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康。該病的發(fā)生、發(fā)展涉及多因素，是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程[1]。研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展的分子機(jī)制對于鑒別腫瘤良惡性、判斷惡性腫瘤預(yù)后以及尋找新的有效治療靶點(diǎn)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[2]。增殖與轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌的重要特點(diǎn)之一，是造成患者死亡的主要原因[3]。大量研究表明，惡性腫瘤中整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的表達(dá)與腫瘤的增殖密切相關(guān)。近年文獻(xiàn)報(bào)道，ILK在幾種人類腫瘤中的表達(dá)顯著增高[4]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)是維持正常細(xì)胞生存所必需的腫瘤抑制因子，具有磷酸酯酶活性。PTEN能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和侵襲等過程，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。人類多種癌癥中發(fā)現(xiàn)，PTEN的失調(diào)可導(dǎo)致其抑癌功能減弱，對于癌癥研究有重要意義。因此本研究采用體內(nèi)檢測結(jié)合體外研究的方法，探討PTEN與ILK二者之間的關(guān)系及其對子宮內(nèi)膜癌增殖和遷移的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RL95-2、Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛購自北京碧云天有限公司。

1.2 患者資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在2018年1月至2021年12月期間手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織243例(腫瘤組)和癌旁正常組織37例(對照組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診均為原發(fā)腫瘤；排除標(biāo)準(zhǔn)：行術(shù)前新輔助放化療，伴轉(zhuǎn)移瘤、復(fù)發(fā)腫瘤,伴有心腦血管疾病及其他手術(shù)禁忌證。臨床資料收集患者的腫瘤分期以及患者生存期等指標(biāo)，分析PTEN與ILK蛋白表達(dá)與臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性(生存分期收集近3年內(nèi)術(shù)后子宮內(nèi)膜癌癌患者數(shù)據(jù))。所有患者治療均以手術(shù)切除為主。

本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)(20190454)。

1.3 免疫組化 標(biāo)本組織依次進(jìn)行石蠟切片、脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加PTEN與ILK(1∶1 000)一抗、加二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片以及切片掃描儀掃描分析。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評估標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒的細(xì)胞，或染色>25%的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。平均陽性染色面積百分比法分析免疫組化結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)，接種6孔板，使轉(zhuǎn)染日細(xì)胞融合度為80%。在100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中分別加入2 μg pcDNA3.1-NC及pcDNA3.1-PTEN，再分別和100 μL含10 μL Lipofectamine的無血清DMEM培養(yǎng)基混合為轉(zhuǎn)染試劑，室溫保溫30 min。用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞后每孔加入0.8 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，加入0.2 mL 轉(zhuǎn)染試劑。對照組細(xì)胞不加轉(zhuǎn)染試劑，其他兩組細(xì)胞分別加入含 pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-PTEN的轉(zhuǎn)染試劑。37℃、5%CO2培養(yǎng)5 h，加入含血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后換篩選培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)基G418的濃度為500 μg/mL。篩選培養(yǎng)約20 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

轉(zhuǎn)染前1 d，對數(shù)期細(xì)胞在6孔板中過夜，密度為3×105/well，每孔放2.5 mL不含抗生素的生長培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長密度達(dá)60%，細(xì)胞中去除生長培養(yǎng)基，加入1.5 mL新鮮的不含血清的生長培養(yǎng)基。對于每個(gè)轉(zhuǎn)染的孔，按照如下方法分別準(zhǔn)備si-NC，si-ILK (50 nmol/L)和 Lipofectamine RNAiMAX 混合物，在250 μL的無血清生長培養(yǎng)基中加入100pmol siRNA，柔和混勻。Lipofectamine RNAiMAX使用前先混勻，然后在250 μL生長培養(yǎng)基中加入5 μL，Lipofectamine RNAiMAX進(jìn)行稀釋，室溫下溫育5 min。混合稀釋好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室溫下溫育20 min。加入混合物到含有HeLa cells的6孔板中，每孔終體積為2 mL，并輕晃混勻。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞 5～6 h。更換含有血清的培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞48 h，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，供后續(xù)使用

1.5 CCK-8 RL95-2、Ishikawa和HEC-1B中敲減ILK表達(dá)和過表達(dá)PTEN，培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)70%，收集細(xì)胞制備為1×104·mL-1細(xì)胞懸液。96孔板每孔添加細(xì)胞懸液100 μL，分別于0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度值。

1.6 Western blotting 調(diào)整細(xì)胞數(shù)6×104·mL-1，細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，然后在4℃ 15 000×g下離心30 min，隨后4℃離心吸取上清即提供總蛋白質(zhì)。隨后蛋白質(zhì)定量后并計(jì)算上樣量，加上樣緩沖液，樣品100℃煮5 min。SDS-PACE凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVD膜，脫脂牛奶封閉。然后在4℃下與初級抗體一起孵育過夜，ILK(1∶1 000)、PTEN(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)，次日再與二抗孵育，PBS清洗，ECL發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光拍照，Image-J軟件分析western blot灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN和ILK在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中的表達(dá) PTEN陽性面積在對照組正常子宮內(nèi)膜組織為(37.04±10.54)%顯著高于腫瘤組中陽性面積(9.22±1.76)%；而ILK在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中陽性面積為(29.19±8.87)%顯著高于正常組織(12.34±2.43)%。見圖1。

注：與對照組相比**P<0.01，***P<0.001，標(biāo)尺=20 μm

2.2 PTEN和ILK與子宮內(nèi)膜癌患者病理特征間的關(guān)系 PTEN陰性和ILK陽性與子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展期加重、病理分級嚴(yán)重性、腫瘤組織浸潤性以及ER、PR和Ki-67呈顯著正相關(guān)，見表1。

表1PTEN和ILK與子宮內(nèi)膜癌患者病理特征間的關(guān)系 例(%)

2.3 PTEN和ILK對子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后生存期的影響 術(shù)后隨訪243例患者的生存期材料，通過生存期分析，發(fā)現(xiàn)PTEN低表達(dá)患者中位生存期為27.98個(gè)月；PTEN高表達(dá)患者中位生存期為32.78個(gè)月(圖2-A)；ILK低表達(dá)患者中位生存期為29.87個(gè)月；ILK高表達(dá)患者中位生存期為18.9個(gè)月(圖2-B)。

注：A： PTEN表達(dá)與患者預(yù)后生存期關(guān)系；B：ILK表達(dá)與患者預(yù)后生存期關(guān)系

2.4 PTEN和ILK對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系增殖能力影響 敲減ILK表達(dá)后，在24～72 h，RL95-2細(xì)胞增殖OD值在0.32±0.05～0.74±0.15，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.37±0.01～0.89±0.03(圖3-A)；Ishikawa細(xì)胞增殖OD值在0.32±0.06～0.98±0.12，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.46±0.04～1.13±0.36(圖3-B)3；HEC-1B細(xì)胞增殖OD值在0.39±0.07～0.95±0.27，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.48±0.05～1.07±0.32(圖3-C)。

過表達(dá)PTEN后，在24～72 h，RL95-2細(xì)胞增殖OD值在0.35±0.08～0.67±0.03，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.37±0.01～0.89±0.03(圖3-A)；Ishikawa細(xì)胞增殖OD值在0.37±0.06～0.75±0.13，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.46±0.04～1.13±0.36(圖3-B)；HEC-1B細(xì)胞增殖OD值在5.76±0.98～9.23±1.23，對照組細(xì)胞增殖OD值在0.34±0.05～0.79±0.18(圖3-C)。

注：A 敲減ILK和過表達(dá)PTEN后RL95-2細(xì)胞增殖；B：敲減ILK和過表達(dá)PTEN后Ishikawa細(xì)胞增殖；C： 敲減ILK和過表達(dá)PTEN后HEC-1B細(xì)胞增殖(與pcDNA組相比*P<0.05, 與NC組相比**P<0.01)

2.5 PTEN通過調(diào)控ILK的表達(dá)發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖作用 與對照組細(xì)胞相比，ILK隨著PTEN過表達(dá)，在RL95-2細(xì)胞中表達(dá)僅為對照組細(xì)胞23/100，在Ishikawa細(xì)胞中表達(dá)僅為對照組細(xì)胞6/25，在HEC-1B細(xì)胞中表達(dá)為對照組細(xì)胞2/5(圖4)；與對照組細(xì)胞相比，PTEN隨著ILK敲減，在RL95-2、Ishikawa和HEC-1B中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖4 過表達(dá)PTEN后子宮內(nèi)膜細(xì)胞細(xì)胞ILK表達(dá)(與pcDNA組相比***P<0.001)

圖5 敲減ILK后子宮內(nèi)膜細(xì)胞細(xì)胞PTEN表達(dá)(與siRNA組相比***P<0.001)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌已經(jīng)成為威脅女性健康的一類惡性疾病，其發(fā)病率在女性群體中逐年增高[7]。雖然目前關(guān)于子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究已有很多，但是因其復(fù)雜的致病因素和發(fā)病機(jī)制，目前尚無明確有效的臨床治療靶分子。本課題組經(jīng)過研究提出一種可能的潛在對子宮內(nèi)膜癌治療具有一定作用的分子通路，即PTEN/ILK信號通路對子宮內(nèi)膜癌作用。

PTEN是維持正常細(xì)胞生存所必需的腫瘤抑制因子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌作用[8-9]，主要是通過抑制PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用[10]。但是其在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少，已有的研究更多關(guān)注PTEN對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷價(jià)值[11]，忽略其對腫瘤發(fā)展重要因素增殖能力的影響。ILK對細(xì)胞生長、分化、黏著和遷移具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[12]，在多種腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)其可能發(fā)揮促癌作用[13-15]，與PTEN發(fā)揮作用相反。在子宮內(nèi)膜癌研究中，前期研究者關(guān)注了ILK對子宮內(nèi)膜癌病理分期分型的影響，對ILK與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系和機(jī)制探討較少。因此本研究重點(diǎn)在前期文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上進(jìn)一步關(guān)注PTEN/ILK對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能的作用機(jī)制。

通過免疫組化檢測PTEN/ILK在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTEN在子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織陽性面積大于正常組織，而ILK表達(dá)則相反，進(jìn)一步分析PTEN/ILK與患者病理分級、腫瘤分期還有是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，結(jié)果均提示PTEN在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮抑癌作用，ILK發(fā)揮促癌作用，這一結(jié)果通過子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后生存期分析進(jìn)一步得到驗(yàn)證。上述研究和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，均明確PTEN和ILK分別與子宮內(nèi)膜癌患者病理特征等之間的關(guān)系，為體外研究提供一定基礎(chǔ)。

體外研究以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系RL95-2、Ishikawa和HEC-1B為研究對象，三株細(xì)胞系分別過表達(dá)PTEN表達(dá)，敲減ILK表達(dá)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著ILK敲減，24～72 h內(nèi)三株細(xì)胞增殖能力顯著降低，而過表達(dá)PTEN后24～72 h內(nèi)三株細(xì)胞增殖同樣被抑制，結(jié)果說明PTEN能夠發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用，而ILK發(fā)揮作用相反，起到促增殖作用。有文獻(xiàn)指出PTEN能夠調(diào)控PI3K/AKT信號通路，而ILK依賴于PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用[10,15]，因此接下來本研究重點(diǎn)關(guān)注PTEN與ILK之間的調(diào)控調(diào)控關(guān)系，結(jié)果提示隨著PTEN的過表達(dá)，ILK表達(dá)顯著降低，而敲減ILK對PTEN的表達(dá)無顯著影響，提示PTEN位于ILK的上游，發(fā)揮調(diào)控作用，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步證實(shí)PTEN和ILK在子宮內(nèi)膜癌中存在密切相關(guān)的關(guān)系，對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

綜上所述，本研究初次研究了PTEN和ILK二者在子宮內(nèi)膜癌中的相互關(guān)系以及其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用影響，結(jié)果表明PTEN很可能通過負(fù)調(diào)控ILK的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用，有望成為子宮內(nèi)膜癌新的治療靶點(diǎn)。但是本研究具有一定的局限性，PTEN和ILK之間具體的調(diào)控機(jī)制如何，本研究尚未完全解釋清楚，二者是通過PI3K/AKT信號通路相互調(diào)控，還是通過其他信號通路發(fā)揮作用，將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明：論文內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為葛靜、代麗麗和陳然，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為代麗麗，王景、王旭、劉晶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評估，代麗麗執(zhí)筆，陳然審校。