徐寒子, 劉夢雨, 袁盛龍, 李惠欣, 李陽, 尹萍, 貢震△

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、江蘇省腫瘤醫(yī)院、江蘇省腫瘤防治研究所放療科(江蘇南京 210009)； 2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、南京市婦幼保健院婦科(江蘇南京 210004)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)約占女性癌癥總數(shù)的7%，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一[1]。近年來，我國EC發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢，尤其在北京、上海等發(fā)達(dá)城市已經(jīng)躍居首位[2]，病死率更翻了1倍[3]。由于近30%EC患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期，即便采用綜合療法其術(shù)后生存率仍無明顯改善[4]，且放化療本身亦存在一定毒副反應(yīng)，因此臨床迫切需要新的、尤其天然低毒的診治藥物。多肽(peptide)由3個或3個以上的氨基酸脫水縮合而成，廣泛作用于機(jī)體的細(xì)胞、神經(jīng)、激素等，幾乎參與了包括細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)甚至腫瘤形成等在內(nèi)的所有生理活動[5-6]。近年來，關(guān)于多肽致病作用的研究越來越多。尤其是多肽以其分子量小(通常不超過10 kD)、毒副作用小及靶向性強(qiáng)等優(yōu)勢，成為抗腫瘤研究的熱點[7-8]。隨著多肽組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的人體組織肽段分析為具有潛在生物學(xué)活性的內(nèi)源性多肽的挖掘提供了可能，且已被應(yīng)用于多種腫瘤診斷或治療靶點的篩選，如胰腺癌[6]、膀胱癌[9]、卵巢癌[10-11]等。然而，多肽組學(xué)在EC組織中的應(yīng)用目前鮮見報道。本研究收集2018年1—12月EC組織及正常子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行LC-MS/MS多肽組學(xué)分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與組織樣本 人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞(HEC-1-A)購自中科院上海細(xì)胞庫。EC組織來自3例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的術(shù)后標(biāo)本(以同期3例年齡匹配的健康女性子宮內(nèi)膜樣本為對照)；3例患者術(shù)前沒有接受包括放化療在內(nèi)的任何治療，且不合并有任何其他惡性腫瘤病史，術(shù)后均得到明確的病理學(xué)診斷。本研究所有組織均取自本院并經(jīng)該院倫理委員會批準(zhǔn)(2018-18)，所有患者術(shù)前均簽署知情同意書，所有標(biāo)本均在術(shù)后立即置液氮儲存以備多肽提取。

1.2 主要試劑和材料 McCoy′s 5A細(xì)胞培養(yǎng)基、Cell Counting Kit 8試劑盒等(凱基，中國)；BCA 蛋白測定試劑盒(Pierce，美國)；胎牛血清(ExCell，美國)；細(xì)胞培養(yǎng)皿、Transwell小室(Corning，美國)；超濾離心管(Millipore，美國)，RNA柱式提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，中國)，全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及蛋白上樣緩沖液(碧云天，中國)，E-cadherin抗體、beta Catenin抗體、Vimentin抗體(abcam，英國)，GAPDH抗體(proteintech，美國)。

1.3 多肽的提取與LC-MS/MS上樣檢測 標(biāo)本的采集與多肽的提取、分析按實驗室前述技術(shù)路線實施[11]，標(biāo)本置于玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解液，于冰上手動研磨10 min后于4℃超聲裂解60 min，10 000 r/min速度下離心10 min，將上清液以BCA法定量備用。取適量以3 kD超濾離心管12 000 r/min速度下離心10 min以去除蛋白質(zhì)和大于3 kD的多肽，收集過濾液加入10 mmol/L的DTT(DL-Dithiothreitol)溶液于56℃水浴中還原1 h；加入50 mmol/L的IAA (Iodoacetamide)溶液避光反應(yīng)40 min，于4℃在12 000 r/min速度下離心10 min，使用自填脫鹽柱脫鹽，于45℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑備用[12]。樣品以溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解，充分振蕩渦旋離心后行LC-MS/MS上樣檢測，上述實驗均在南京百睿笛生物技術(shù)有限公司實施。

1.4 潛在生物活性多肽的篩選與制備 鑒定獲得多肽以Wxpasy工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)在線查詢其分子量(Mw)，其前體蛋白以UniProt網(wǎng)站(https://www.uniprot.org)進(jìn)行比對，預(yù)測多肽相關(guān)前體蛋白與EC生存關(guān)系從而篩選可能具有潛在生物活性的多肽則借助在線工具The Human Protein Atlas(HPA，www.proteinatlas.org)；前體蛋白的功能注釋則通過String數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)來檢索。并進(jìn)一步由南京百睿笛生物技術(shù)有限公司定制合成多肽，瞬離后用PBS溶解分裝，-20℃保存以備后續(xù)試驗使用。

1.5 CCK-8法進(jìn)一步篩選確證多肽對EC細(xì)胞的增值抑制活性 以每孔4 000個接種HEC-1-A細(xì)胞于96孔板，置 37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)基后加100 μL含不同濃度目的多肽的培養(yǎng)基(1%FBS)，分別培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，各孔中加入含10 μL CCK-8檢測溶液的新鮮培養(yǎng)基37℃下孵育1～4 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度。

1.6 Transwell實驗檢測多肽對EC細(xì)胞的侵襲抑制活性 將小室放入24孔板中，下室加600 μL完全培養(yǎng)基；消化、計數(shù)HEC-1-A細(xì)胞后，上室加200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含目的多肽)制成的細(xì)胞懸液[(1～10)×104個細(xì)胞/孔]。將24孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，棄去培養(yǎng)基，每孔加1 mL 4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞30 min。后上室加50 μL、下室加300 μL結(jié)晶紫染液染色30 min，用棉簽擦去孔膜上層的細(xì)胞，PBS清洗后拍攝膜底層細(xì)胞(100×，4～6個視野；40×全圖)。

1.7 劃痕實驗檢測多肽對EC細(xì)胞的遷移抑制活性 接種HEC-1-A細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞完全貼壁且鋪滿約70%～80%，用10 μL槍頭在每孔板底部均勻筆直的劃出約1 mm細(xì)痕，PBS漂洗2～3次洗去劃掉脫落細(xì)胞，以100 μmol/L終濃度的目的多肽處理接種細(xì)胞，顯微鏡下觀察在劃痕后的0、48 h各組細(xì)胞的劃痕愈合情況，并拍照記錄，分析細(xì)胞遷移情況。

1.8 RT-PCR及Western Blot檢測Wnt/β-catenin/EMT通路相關(guān)分子的表達(dá) 以100 μmol/L多肽PDAEP-1處理HEC-1-A細(xì)胞(對照組為不含PDAEP-1的培養(yǎng)液)，48 h后分別以RNA柱式提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以NCBI軟件設(shè)計引物，并由上海生工生物工程股份科技有限公司合成后行Real time-PCR。同前處理HEC-1-A細(xì)胞后，以全蛋白抽提試劑盒(碧云天公司產(chǎn)品)提取蛋白并定量后行SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，室溫下?lián)u床60 min，一抗孵育4℃過夜，二抗孵育后行ECL顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 潛在生物學(xué)活性多肽的篩選 經(jīng)LC-MS/MS檢測，共鑒定獲得近400條內(nèi)源性多肽，長度主要分布于8～10、10～12、12～14、14～16肽段。通過Wxpasy工具計算，其分子量大多位于<1 000 Da、1 000 Da≤分子量<1 200 Da、1 200 Da≤分子量<1 400 Da、1 400 Da≤分子量<1 600 Da區(qū)間段。

上述所有鑒定獲得的多肽均經(jīng)UniProt網(wǎng)站的比對，其中序列TAGNVLMH(分子量為841.98 Da，等電點6.40)對應(yīng)的前體蛋白基因為SLC38A10(前體蛋白為Putative sodium-coupled neutral amino acid transporter 10)，見圖1-A。SLC38A10主要表達(dá)在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是一個10次跨膜蛋白，功能上與谷氨酰胺代謝和蛋白合成有關(guān)。所有多肽對應(yīng)的前體蛋白均經(jīng)HPA網(wǎng)站檢索，發(fā)現(xiàn)該多肽的前體SLC38A10在子宮內(nèi)膜組織中無論是RNA水平(圖1-B)還是蛋白水平(圖1-C)均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)；進(jìn)一步的生存分析顯示其不僅為腎癌和胰腺癌預(yù)后標(biāo)志物，且高表達(dá)SLC38A10的EC患者5年生存率顯著高于低表達(dá)患者(P<0.05)，見圖1-D。鑒于多肽的生物學(xué)功能往往與其前體蛋白相近(或相反)，提示TAGNVLMH可能是一條與EC預(yù)后也高度相關(guān)的功能多肽，我們將其稱之為PDAEP-1 (protein derived anti-EC peptide-1)。String數(shù)據(jù)庫前體蛋白的功能注釋提示，其可能主要與ENTHD2、KIF27B、FAM178A、TBC1D22A、ZNF516等靶標(biāo)相互作用，見圖1-E。

注：A：多肽PDAEP-1前體信息(UniProt網(wǎng)站比對)；B：多肽PDAEP-1前體蛋白在子宮內(nèi)膜組織中RNA表達(dá)水平(HPA網(wǎng)站檢索)；C：多肽PDAEP-1前體蛋白在子宮內(nèi)膜組織中蛋白表達(dá)水平(HPA網(wǎng)站檢索)；D：多肽PDAEP-1前體表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的影響(HPA網(wǎng)站檢索)；E：PDAEP-1前體靶標(biāo)蛋白相互作用關(guān)系注釋(String數(shù)據(jù)庫)

2.2 PDAEP-1抗EC活性的進(jìn)一步篩選確證 PDAEP-1對EC細(xì)胞HEC-1-A在25～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用，與0 μmol/L濃度組(空白對照組)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 PDAEP-1對EC細(xì)胞增殖活性的體外抑制

2.3 PDAEP-1體外對EC細(xì)胞侵襲、遷移功能的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組HEC-1-A細(xì)胞較PDAEP-1組顯著增多(圖2-A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。劃痕實驗結(jié)果顯示，PDAEP-1處理組劃痕的愈合速度明顯低于對照組(圖2-B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

注：A:多肽PDAEP-1處理HEC-1-A細(xì)胞后典型Transwell結(jié)果；B:多肽PDAEP-1處理HEC-1-A細(xì)胞后典型劃痕實驗結(jié)果

表2 PDAEP-1體外對 EC細(xì)胞侵襲、遷移功能的影響

2.4 PDAEP-1體外對EC細(xì)胞Wnt/β-catenin/EMT通路相關(guān)分子表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，PDAEP-1作用HEC-1-A細(xì)胞后Vimentin、β-catenin兩者的mRNA水平均顯著降低，而E-cadherin則呈上調(diào)狀態(tài)(P<0.05)，見表3。Western Blot結(jié)果顯示E-cadherin、 Vimentin、 β-catenin的蛋白表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化基本一致，與對照組比較，PDAEP-1組Vimentin、β-catenin的蛋白達(dá)水平亦顯著降低，而E-cadherin則呈上調(diào)狀態(tài)(P<0.05)。見圖3、表4。

表3 E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相對表達(dá)水平

3 討論

EC的惡性進(jìn)展涉及從抑癌基因與癌基因失衡，到細(xì)胞增殖與凋亡失控，以及腫瘤微環(huán)境中各類細(xì)胞因子共同參與完成的諸多方面[13]。如有研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白α亞基14(GNA14)刺激Krüppel樣因子7(KLF7)通過上調(diào)透明質(zhì)酸合酶2(HAS2)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的惡性生長[14]；蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)通過與雌激素受體α(ERα)相互作用并影響細(xì)胞周期信號通路，在EC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[15]。MDH-2在EC內(nèi)過表達(dá)，受雌激素E2激活后可抑制PTEN的表達(dá)，促進(jìn)EC腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移而子宮內(nèi)膜局部巨噬細(xì)胞浸潤所分泌的細(xì)胞因子IL-17A，可上調(diào)雌激素受體ERα的敏感性，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[16]。然而，從整體上講，目前對EC發(fā)病、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究仍然不夠透徹，進(jìn)一步剖析EC 惡性進(jìn)展機(jī)制，尋找新治療靶點并開發(fā)新的治療藥物，成為當(dāng)前婦科腫瘤防治研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點。

隨著多肽組學(xué)的不斷發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識到小分子多肽功能的多樣性，如：抗菌肽(LL-37)的廣譜殺菌作用、降壓肽(ACEIP)的降壓作用、心房肽(ANP)的利尿作用[17]等。多肽的抗腫瘤作用也同樣成為研究的熱點，已揭示：RK1可以抑制惡性膠質(zhì)瘤及黑素瘤細(xì)胞的增殖、遷移[18]；泥蟹抗菌肽Scyreprocin通過破壞細(xì)胞膜和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌活性，有望成為肺癌治療候選藥物[19]；LyeTxI-b是一種源自蜘蛛毒液的合成肽，在三陰性乳腺癌細(xì)胞中具有高度抗腫瘤活性，并呈現(xiàn)出與順鉑的協(xié)同作用[20]。已知內(nèi)源性多肽主要來源于內(nèi)源性蛋白的酶解或由非編碼RNA編碼，已有多個研究應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對肺癌、卵巢癌、泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤等多種腫瘤組織中的內(nèi)源性多肽進(jìn)行了鑒定與分析，并從中發(fā)現(xiàn)了諸多有望成為腫瘤診斷與治療藥物的多肽[7，9-11]。甚至，源于腫瘤細(xì)胞凋亡因子的多肽dTCApFs已被運(yùn)用于治療局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌及胰腺癌的Ⅰ期臨床試驗，且安全性及耐受性良好[21]。以上研究表明，多肽與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為我們從多肽的角度深入挖掘影響EC 惡性進(jìn)展提供了新的線索，將可能為EC 生物治療提供新的手段。

圖3 PDAEP-1調(diào)變Wnt/β-catenin/EMT通路相關(guān)分子的表達(dá)電泳圖

表4 E-cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白相對表達(dá)水平

有鑒于此，我們在前期利用質(zhì)譜技術(shù)開展卵巢癌組織內(nèi)源性多肽組學(xué)分析的基礎(chǔ)上[11]，本研究通過收集3例EC組織標(biāo)本(以3例年齡匹配的健康女性子宮內(nèi)膜樣本為對照)行LC-MS/MS分析，共鑒定獲得近400條內(nèi)源性多肽。

在此基礎(chǔ)上，我們繼而進(jìn)行了生物信息學(xué)分析與篩選，以期獲得具有潛在生物學(xué)活性的多肽。我們首先以UniProt網(wǎng)站對所獲多肽的前體蛋白進(jìn)行比對，其中序列為TAGNVLMH的多肽PDAEP-1對應(yīng)的前體蛋白基因為SLC38A10，且該序列位于SLC38A10的功能區(qū)。鑒于多肽的生物學(xué)功能往往與其前體蛋白相關(guān)，因此我們以HPA網(wǎng)站檢索了該多肽的前體在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其RNA、蛋白水平均呈高表達(dá)；進(jìn)一步的生存分析顯示，其不僅為腎癌和胰腺癌預(yù)后標(biāo)志物，且高表達(dá)SLC38A10的EC患者5年生存率顯著高于低表達(dá)患者(P<0.05)，因此我們推測PDAEP-1可能是一條與EC預(yù)后高度相關(guān)的功能多肽。

緊接著，我們初步探討了該內(nèi)源性多肽的體外抗腫瘤活性。我們按照TAGNVLMH序列化學(xué)合成得到多肽PDAEP-1并處理HEC-1-A細(xì)胞，CCK8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDAEP-1對EC細(xì)胞在0～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用，進(jìn)一步證實PDAEP-1是一條具有潛在抗EC生物學(xué)活性的多肽。

繼而，我們又以100 μmol/L的濃度處理HEC-1-A細(xì)胞，分別以Transwell實驗、劃痕實驗測試了其對HEC-1-A細(xì)胞侵襲、遷移的影響，結(jié)果提示多肽PDAEP-1對EC細(xì)胞的侵襲、遷移有明顯的抑制作用。上述結(jié)果進(jìn)一步佐證了我們的推測，即PDAEP-1是一條針對EC具有抑制其侵襲轉(zhuǎn)移活性的多肽。

已知Wnt/β-catenin/ EMT(epithelial-mesenchymal transition)通路對惡性腫瘤的進(jìn)展，尤其對EC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮著重要作用[22-24]。其中，E-cadherin(CDH1)屬于鈣依賴的同種親和性黏附分子，可促進(jìn)上皮細(xì)胞間黏附，其黏附功能的維持與β-catenin密切相關(guān)；Vimentin是一種Ⅲ型中間絲蛋白， EMT期間表達(dá)上調(diào)；β-catenin參與細(xì)胞間黏附，同時也具有信號傳導(dǎo)功能。因此，我們選定三者為代表，考察了其在PDAEP-1作用EC細(xì)胞后的表達(dá)情況。PCR結(jié)果顯示，較之對照組，PDAEP-1作用HEC-1-A細(xì)胞后Vimentin、β-catenin兩者的mRNA水平均顯著降低，而E-cadherin則呈上調(diào)狀態(tài)。而Western Blot方法檢測結(jié)果顯示E-cadherin、Vimentin、β-catenin的蛋白表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化基本一致。因此，盡管尚缺乏體內(nèi)研究；但基于已有的體外檢測結(jié)果，我們有理由認(rèn)為，PDAEP-1所展現(xiàn)的抑制HEC-1-A細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移活性，可能與調(diào)變Wnt/β-catenin/EMT通路相關(guān)分子的表達(dá)有關(guān)。不過，PDAEP-1下游相關(guān)結(jié)合蛋白尚未闡明，其在EC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的具體分子機(jī)制仍不十分明確，有必要在后期通過進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗研究獲得。

綜上所述，本實驗借助多肽組學(xué)方法，初步篩選獲得了在體外具有抑制EC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移活性的新型內(nèi)源性多肽PDAEP-1。鑒于多肽類藥物所具有的諸多優(yōu)勢，PDAEP-1具有在EC診療領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者共同認(rèn)可論文，無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：研究設(shè)計為貢震；研究方案執(zhí)行為徐寒子、李惠欣；數(shù)據(jù)整理為劉夢雨、袁盛龍；統(tǒng)計分析為李陽、尹萍；論文撰寫為徐寒子，論文評閱為貢震。