林佩賢 黃寶添 辜紅妮 黃靖宇 許斐斐 林偉青

1 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，汕頭 515041；2 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院放療科，汕頭 515041

鮑曼不動桿菌（也稱鮑氏不動桿菌）是一種非發(fā)酵的革蘭陰性菌，其中耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）是引起醫(yī)院感染的重要病原菌[1]。根據(jù)中國抗菌藥物監(jiān)測網(wǎng)的報告，約80%的鮑曼不動桿菌對亞胺培南或美羅培南耐藥[2-3]，給臨床抗感染治療帶來較大困難。WHO 公布的新型抗菌藥物研發(fā)重點病原體清單中，CRAB 被列為最受關(guān)注的革蘭陰性菌[4]。ICU 是醫(yī)院感染多發(fā)的科室，ICU 病區(qū)鮑曼不動桿菌和CRAB 所致的醫(yī)院感染分別占20.9%和13.6%[5]，也曾有CRAB 引起醫(yī)院感染流行和暴發(fā)的報道[6-7]。本研究對汕頭某醫(yī)院ICU 病區(qū)患者CRAB的感染特點和同源性進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

對象與方法

一、研究對象

以2020年7月至2021年6月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院ICU 病區(qū)收治的檢出鮑曼不動桿菌患者為研究對象，按檢出菌是否為CRAB 分為病例組和對照組。醫(yī)院感染病例診斷標(biāo)準(zhǔn)按原衛(wèi)生部2001年《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》執(zhí)行。納入排除標(biāo)準(zhǔn)：納入檢出鮑曼不動桿菌的病例，排除住院時間少于48 h 的病例，同次住院期間檢出耐藥菌的病例不納入對照組。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過[審批號：汕大醫(yī)附二倫審科（2022-104）號]。

二、菌株鑒定和藥敏試驗

檢測患者入院后的痰液或分泌物，收集檢出的第1 株鮑曼不動桿菌菌株。按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3 版要求分離培養(yǎng)病原菌，參照2019年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的藥敏試驗要求[8]，采用法國梅里埃公司的VITEKcompact2 微生物自動分析儀和配套藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗。以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853 進(jìn)行藥敏質(zhì)控檢測。

三、PFGE 試驗

挑取鮑曼不動桿菌單菌落接種營養(yǎng)平板，37 ℃孵育過夜。制備膠塊，使用60 U ApaⅠ（TAKARA 公司）內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在37 ℃孵育4 h。在CHEF-DRⅢ（Bio-Rad Laboratories 公司）電泳儀中進(jìn)行脈沖場電泳，使用GelRed 核酸染料染色，在讀膠儀中成像。PFGE 圖像錄入BioNumerics 軟件包進(jìn)行處理，經(jīng)校正后根據(jù)每兩個圖像之間的相似性系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。PFGE 分型標(biāo)準(zhǔn)： 圖譜條帶數(shù)量和大小相同為同一型別，3 個條帶以下有差異為同一型別的不同亞型，4 個條帶以上差異為不同型別。

四、耐藥基因檢測

參照QUIGEN 試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA 制備DNA 模板。PCR 擴(kuò)增：（1）VIM、IMP、SIM、NDM-1、ADC 各靶基因 PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，模版1 μL；擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，其中退火溫度VIM、IMP 和ADC 為55 ℃，NDM-1 和SIM 為58 ℃，退火時間均為30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)，72 ℃最后延伸6 min。取PCR 反應(yīng)產(chǎn)物4 μL，以1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳25 min 后凝膠成像系統(tǒng)成像。陽性PCR 產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序。（2）OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58 和OXA-143：多重PCR 法，反應(yīng)體系為20μL：2×Taq Master Mix10 μL，ddH2O 4 μL，正反向引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板1 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30 個循環(huán)，72 ℃最后延伸6 min。取PCR 反應(yīng)產(chǎn)物4 μL，以1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳25 min 后凝膠成像系統(tǒng)成像。陽性PCR 產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果開展blast 比對進(jìn)行確認(rèn)。目的基因和引物序列詳見表1。

表1 目的基因和引物序列

五、統(tǒng)計學(xué)分析

以Epidata3.1 雙錄入并核對數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)性檢驗方法采用P-P圖和Shapiro-Wilk 檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立兩樣本均數(shù)t 檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、感染患者一般情況

感染鮑曼不動桿菌患者共41 例，按檢出菌是否為CRAB 分為病例組（17 例）和對照組（24 例），其中病例組男性12 例，女性5 例，年齡為(52.06±21.28)歲；對照組男性22 例，女性2 例，年齡(49.17±20.44)歲，兩組性別、年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義( χ2=3.12，P=0.077；t=0.44，P=0.663)。結(jié)合臨床表現(xiàn)，病例組和對照組分別有13 例和15 例判斷為感染菌，均為肺部感染，余考慮為定植菌。

二、抗菌藥物使用、院感發(fā)生情況和轉(zhuǎn)歸比較

病例組使用碳青霉烯類抗菌藥物、抗菌藥物使用天數(shù)≥10 d、檢出菌為醫(yī)院感染病原菌的比例分別為9/17、14/17 和12/17，均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ χ2=6.05、9.62 和5.53，P 均＜0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院ICU 病區(qū)患者的抗菌藥物使用、機(jī)械通氣、院感發(fā)生情況和轉(zhuǎn)歸比較

三、CRAB 菌株耐藥性及同源性分析

1、藥物敏感試驗結(jié)果

由表3可見，檢出的CRAB 除對替加環(huán)素敏感外，對其他抗菌藥物均呈不同程度耐藥。對亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢吡肟和復(fù)方磺胺甲 唑的耐藥/中介率均在80%以上，頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為11/17，氨基糖苷類中妥布霉素的敏感率稍高，為6/17。

表3 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院ICU 病區(qū)耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的藥敏結(jié)果（n=17，株）

2、同源性及耐藥基因分析

經(jīng)PFGE 電泳圖譜聚類分析，17 株CRAB 分為9 個型別，見圖1。其中5 個型別只包含1 株菌株，其余4 個型別分別包含2～4 株菌株，提示可能存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。17 株菌中有16 株檢出ADC 基因，1株檢出SIM 基因，8 株檢出OXA-51-like 基因。4 株CRAB 菌株檢測出多個耐藥基因。

圖1 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院ICU 病區(qū)耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的PFGE 聚類分析圖

討論

隨著亞胺培南在臨床上的廣泛應(yīng)用，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的臨床分離菌株越來越多[9]。為應(yīng)對此類廣泛耐藥細(xì)菌所致感染，檢驗科需要積極與臨床醫(yī)生溝通，開展多黏菌素、替加環(huán)素和頭孢他啶-阿維巴坦的藥敏試驗[10]。本文分析汕頭某醫(yī)院ICU 病區(qū)CRAB 的感染特點和同源性，可更好地指導(dǎo)臨床用藥并有效控制相關(guān)醫(yī)院感染。

一、CRAB 菌株耐藥率較高

本次研究結(jié)果顯示，CRAB 感染患者與一般鮑曼不動桿菌患者的性別、年齡無差異，但感染前使用碳青霉烯類抗菌藥物和長時間抗菌治療者檢出CRAB 的概率增加，長時間使用抗菌藥物促使耐藥菌的產(chǎn)生，應(yīng)持續(xù)加強碳青霉烯類抗菌藥物合理用藥管理[11]。藥敏結(jié)果顯示，CRAB 菌株對除了替加環(huán)素外的抗菌藥物耐藥率均高，基于碳青霉烯類耐藥菌株的廣泛耐藥特征，常規(guī)藥敏試驗結(jié)果往往顯示僅對替加環(huán)素、多黏菌素和頭孢他啶-阿維巴坦敏感。同時，報道顯示此類患者的住院費用和住院日數(shù)也增加[12]。CRAB 菌株多為醫(yī)院感染致病菌，因此控制CRAB 菌株在醫(yī)院環(huán)境的流行傳播是醫(yī)院感染防控工作的重要內(nèi)容。

二、CRAB 存在ICU 環(huán)境內(nèi)傳播

ICU 內(nèi)患者和環(huán)境中存在鮑曼不動桿菌的克隆傳播，造成環(huán)境污染以及患者交叉感染[13]。本研究發(fā)現(xiàn)大部分CRAB 為醫(yī)院感染菌，部分PFGE 型別存在多個克隆菌株?，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)ICU 收治的時間有重疊，由同組醫(yī)護(hù)人員診療護(hù)理，工勤人員進(jìn)行床單元清潔消毒存在順序錯誤、同一清潔巾擦拭范圍過大等不規(guī)范的情況。結(jié)合病例的住院時間、診療護(hù)理和清潔消毒情況分析，表明雖然散發(fā)菌株可能為外部輸入，但院內(nèi)傳播仍是CRAB 流行傳播的主要形式。ADC 基因是CRAB 固有耐藥基因[14]，本次檢測在17 株CRAB 菌株中有16 株檢出ADC 基因，與既往研究結(jié)果基本相符[15]。約1/4 的菌株包含2種以上耐藥基因，說明其耐藥機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性。

三、應(yīng)采取綜合干預(yù)措施加強CRAB 防控

主動監(jiān)測、強化接觸隔離和限制抗菌藥物使用可減少CRAB 的感染和定植[16]。CRAB 醫(yī)院感染流行或暴發(fā)與環(huán)境及物體表面清潔消毒不到位有關(guān)，曾有報告ICU 的器械開關(guān)檢出的鮑曼不動桿菌與患者檢出菌株完全同源[17]。醫(yī)護(hù)人員流動性大、崗前培訓(xùn)不足導(dǎo)致床單位終末消毒不徹底可能是CRAB傳播的重要原因[18]。

綜上所述，CRAB 感染的防控需要采取加強手衛(wèi)生、個人防護(hù)、培訓(xùn)督導(dǎo)、落實日常消毒和終末消毒、規(guī)范抗菌藥物使用等一系列綜合干預(yù)措施。但本研究未同步對病房環(huán)境進(jìn)行微生物學(xué)采樣和同源性分析，以進(jìn)一步驗證CRAB 在病房環(huán)境中的傳播情況，有待以后的研究中進(jìn)行深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明林佩賢：研究設(shè)計和實施、文章撰寫、統(tǒng)計分析、獲取經(jīng)費；黃寶添：研究實施、統(tǒng)計分析、文章審閱；辜紅妮、黃靖宇：實驗操作、采集數(shù)據(jù)；許斐斐：采集及核校數(shù)據(jù)；林偉青：研究設(shè)計指導(dǎo)、論文審閱