李先義，張金磊，陳永發(fā)，張 飛，鞏婧婷，王 遠(yuǎn)

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心，新疆 石河子 832000）

目前，檢測地西泮比較常用的方法有液相色譜法[7]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[10]等。但是，針對(duì)雞蛋中地西泮的檢測方法未見報(bào)道。通過對(duì)提取溶劑和凈化方法等前處理?xiàng)l件的選擇，且優(yōu)化了液相條件和質(zhì)譜參數(shù)，建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測雞蛋中地西泮的方法，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、高效、快速，適用于雞蛋中地西泮殘留的篩查和測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇、乙腈、甲酸（HPLC級(jí)），德國CNW公司提供；甲硝唑（純度大于99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；超純水。

雞蛋去殼，經(jīng)勻漿（轉(zhuǎn)速10 000 r/min）后，置于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1200-6460型液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司提供；Sigma 3-30k型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司提供；MS3 basic型漩渦混合器，德國IKA公司提供；KQ-600DE型，昆山市超聲儀器有限公司超聲波清洗器；IQ7000型超純水儀，美國MilliQ公司提供。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱（ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus，3.0 mm×100 mm，3.5 μm），柱溫30℃，流動(dòng)相組成（水-乙腈，梯度），進(jìn)樣量5 μL，流速0.6 mL/min，梯度洗脫。

以水-乙腈為流動(dòng)相的梯度洗脫程序見表1。

表1 以水-乙腈為流動(dòng)相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：離子化模式（電噴霧離子源(ESI)，正離子模式），質(zhì)譜掃描方式（多反應(yīng)監(jiān)測），毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度325℃，干燥氣流量10 L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速12 L/min。

地西泮的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 地西泮的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

稱取經(jīng)勻漿后的雞蛋2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL，渦旋振蕩混勻1 min，30℃下恒溫超聲提取30 min；以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL直接加入到PRiME HLB固相萃取小柱上，無需活化，控制流速在3～4 mL/min，收集全部流出液。于40℃下水浴氮吹至近干，用0.1%甲酸水+甲醇（90+10）溶液定容2 mL，渦旋混勻后過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，供UPLC-MS/MS法測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取地西泮標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用甲醇溶于25 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃下避光保存。準(zhǔn)確移取0.025 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用基質(zhì)空白溶液將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液逐級(jí)稀釋配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的地西泮系列工作溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，供高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對(duì)100 ng/mL甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液多次注射進(jìn)樣，通過對(duì)鞘氣溫度、鞘氣流速、毛細(xì)管電壓、碰撞電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、離子豐度比高和干擾較小的2個(gè)碎片離子作為地西泮的定性離子和定量離子，并以響應(yīng)值較高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。

地西泮的MRM離子對(duì)質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)

圖1 地西泮的MRM離子對(duì)質(zhì)譜圖

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

通過比較水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4種流動(dòng)相體系對(duì)地西泮響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為水-乙腈體系，地西泮的響應(yīng)較高，因此試驗(yàn)選擇水-乙腈體系作為檢測雞蛋中地西泮的流動(dòng)相。

不同流動(dòng)相體系對(duì)地西泮提取效率的影響見圖2。

圖2 雞蛋空白樣品LC-MS/MS譜圖

圖2 不同流動(dòng)相體系對(duì)地西泮提取效率的影響

2.2 提取和凈化條件的選擇與優(yōu)化

機(jī)溶劑中，難溶于水，在乙酸乙酯和乙腈中有較好的溶解性。故選擇乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑，同時(shí)比較了2種溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取時(shí)會(huì)提取出較多的雜質(zhì)，且對(duì)儀器干擾較

大。而乙腈作為提取溶劑時(shí)，不僅提取效率高，且

具有沉淀蛋白的作用。但是，不論乙酸乙酯還是乙

腈作為提取溶劑，提取液中都含有大量的脂肪和磷脂類物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)干擾LC-MS分析，干擾目標(biāo)分析物。所以試驗(yàn)選擇用PRiME HLB小柱進(jìn)行凈化，PRiME HLB小柱可有效去除大部分的脂肪和磷脂類物質(zhì)，從而達(dá)到凈化提取液，降低干擾物的目的。

3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

3.1 線性關(guān)系和檢出限

取6份雞蛋的空白樣品，樣品經(jīng)過前處理得到空白基質(zhì)，取一定量的地西泮標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)溶液稀釋成適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線，在優(yōu)化后的前處理和儀器條件下，對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)行測定，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，地西泮在0.5～10.0 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999（R2=0.999）。根據(jù)信噪比計(jì)算得到，地西泮的檢出限（S/N=3）為0.5 μg/kg，地西泮的定量限（S/N=10）為1 μg/kg。該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。

地西泮的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 地西泮的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

3.2 回收率和精密度

選取1份雞蛋空白樣品，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行3個(gè)濃度水平添加測定回收率，每個(gè)水平重復(fù)測定6次。雞蛋中地西泮平均回收率為85%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～4.7%。結(jié)果表明，該方法回收率和精密度良好。

地西泮的回收率和精密度見表4，雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)見圖3，雞蛋空白樣品LC-MS/MS譜圖見2，雞蛋樣品中添加量為2 μg/kg的LC-MS/MS譜圖見3。

圖3 雞蛋樣品中添加量為2 μg/kg的LC-MS/MS譜圖

表4 地西泮的回收率和精密度

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用ZORBAX SB-Aq型色譜柱分離，優(yōu)化了液相、質(zhì)譜儀器參數(shù)和前處理?xiàng)l件，包括提取溶劑、凈化方法等因素，提高了雞蛋中地西泮的提取和凈化效率。在方法學(xué)驗(yàn)證測定結(jié)果中表明，方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、快速、高效，適于雞蛋中地西泮的快速篩查和測定。